拿到一支冻存管，离真正跑稳实验还有一串细节。下面把从复苏、铺板、传代到功能验证的每一步拆成可复制的 SOP，直接给出关键参数和踩坑提示，照着做即可把细胞维持在最佳性能区间。

冻存管复苏：37 °C 水浴 90 秒的底层逻辑

SV40T 永生化细胞对 DMSO 毒性极敏感。水浴时间 > 2 min，DMSO 渗透压骤变会导致膜破裂；< 60 sec，内部仍残留冰晶，复苏后 24 h 内出现大量漂浮。90 秒是实测存活率 92 % 的临界点。

操作要点：

• 预热 15 mL 37 °C 含 10 % FBS 的 DMEM 完全培养基。
• 冻存管晃动频率 120 rpm，水面低于管帽防止污染。
• 1:10 稀释离心 200 g × 5 min，立即去除上清，防止 DMSO 残留抑制贴壁。

铺板密度：每平方厘米 2.5 × 10^4 细胞的科学依据

密度过低，细胞进入接触抑制延迟，α-SMA 表达量下降 30 %；密度过高，48 h 内即汇合，后期传代次数被迫提前。

实验室实测：6 孔板每孔 9.6 cm2，对应 2.4 × 10^5 细胞，第 3 天达到 80 % 汇合，符合下游转染窗口。

边缘效应处理：外圈孔加入 2 mL PBS，降低蒸发梯度，整板 CV 值可压到 < 5 %。

传代时机：70 % 汇合的显微镜判定

相差显微镜下，细胞呈现“鹅卵石”形态且开始出现轻微方向性排列即达到 70 %。继续培养 6 h 就会进入过度拉伸状态，平滑肌表型快速丢失。

消化方案：

• 0.05 % Trypsin-EDTA，37 °C 30 s，镜下见细胞变圆立即加入 5 mL 完全培养基终止。
• 轻柔吹打 3 次即可，过度机械力会激活 Rho-ROCK 通路，导致收缩表型异常激活。

培养基配方微调：胰岛素与 ROCK 抑制剂双保险

SV40T 永生化过程中 p53 失活，细胞对胰岛素敏感度降低。每 500 mL DMEM 额外添加 5 μg/mL Insulin-Transferrin-Selenium（ITS），可维持 ERK1/2 磷酸化水平。

ROCK 抑制剂 Y-27632（5 μM）在前两代加入，显著减少传代后的应激收缩，撤除后不产生依赖。

支原体快速自检：qPCR 30 min 出结果

传统培养法需 28 天，实验周期等不起。采用 Takara 一步法 qPCR 试剂盒，灵敏度 10 CFU，30 min 循环即可判定。

模板制备：取 1 mL 上清 12 000 g × 5 min，上清直接做 PCR，无需 DNA 抽提。阈值 Ct > 35 视为阴性，发现阳性整批细胞高压灭菌处理，避免气溶胶污染。

功能验证：收缩实验在 96 孔板里完成

传统肌条实验耗材大、通量低。改用胶原包被 96 孔板，每孔 3 × 10^4 细胞，培养 24 h 后换无血清培养基，加 1 μM Ang II 刺激，实时拍照测量面积变化。

结果判读：

• 收缩率 = (初始面积 – 15 min 面积) / 初始面积 × 100 %。
• 永生化细胞收缩率稳定在 28–35 %，低于原代 40 % 但足够用于药物高通量筛选。

冻存回库：90 % FBS + 10 % DMSO 的终极比例

FBS 高于 90 % 会提升 DMSO 毒性，低于 85 % 则冰晶形成概率增加。梯度降温盒 –1 °C / min 至 –80 °C，次日转入液氮。每批次冻存 10 管，贴上二维码标签，扫描即可追踪代次与日期。