复苏首日：时间轴与关键动作

收到干冰包裹立即拍照记录干冰余量，30 min 内置于 37 °C 水浴。震荡频率保持 80 rpm，管口始终在水面以上防止污染。90 s 内融化 90 % 冰晶后，逐滴加入 9 mL 预温完全培养基，稀释 DMSO 至 1 % 以下。800 g 离心 5 min，弃上清，重悬于 1 mL 培养基，接种至明胶预包被 T25 瓶。贴壁 4 h 后首次换液，去除游离死细胞。

培养基配方与每日补液策略

完全培养基：DMEM/F12（1:1）+ 10 % 经活性炭处理的 FBS + 1×ITS-X + 550 nM 氢化可的松 + 250 μM CPT-cAMP + 1 % Pen-Strep。FBS 批次须通过 70 kDa FITC-dextran 渗漏测试验证屏障支持能力。每日补液量按 0.3 mL/cm2 计算，避免液面过高造成剪切力。

传代窗口判定

细胞呈鹅卵石状覆盖 85 % 表面即触发传代。EDTA/胰酶 1:3 混合液消化 90 s，镜下见 50 % 细胞回缩立即终止。离心后按 1:3 分瓶，P5–P30 代区间维持 24 h 倍增节奏。超过 P35 倍增时间延长，需通过单克隆化恢复速率。

TEER 实时监测脚本

24 孔板插入式小室预先平衡 37 °C，接种密度 1 × 10? cells/insert。连接 EVOM2 电阻仪，脚本如下：

• 0 h 记录基准电阻，扣除空白小室背景值。
• 每隔 12 h 读数，连续 72 h 绘制曲线。
• 峰值 ≥ 280 Ω·cm2 视为屏障建成，可启动药物通透性实验。

读数异常 < 200 Ω·cm2 时，检查培养基 pH 与氢化可的松浓度。

药物转运实验标准化流程

使用 14C-蔗糖、3H-地高辛、罗丹明 123 三级探针。

• 顶端侧加药浓度 1 μM，基底侧取样时间点 15、30、60、90 min。
• 计算表观渗透系数 P_app = (dQ/dt)/(A×C?)。
• 质量控制：荧光黄渗漏率 < 1 %/h，确保插入式膜完好。

冻存回退方案

工作细胞库每 10 代冻存一次，冻存液配方：90 % FBS + 10 % DMSO + 5 % 海藻糖。冻存密度 4 × 10? cells/mL，使用程序降温盒 -1 °C/min 至 -80 °C，24 h 后转入液氮。复苏存活率需 ≥ 90 %，低于此值启用备用批次。

常见问题速查表

数据记录模板

每次实验记录：传代次数、接种密度、培养基批号、TEER 峰值、P_app 值、复苏存活率。Excel 模板内置条件格式，TEER < 250 Ω·cm2 自动标红，提示屏障异常。