污染早期信号与应急处理

镜下发现细胞间隙闪光颗粒，48 h 内增殖停滞，多半为支原体。立即执行“三步净化”：

1. 丢弃所有未处理培养瓶，防止气溶胶扩散。
2. 用 BMEC-Detox 培养基（含 50 μg/mL 普拉特霉素）连续传 3 代，每代做 qPCR Ct ≥ 35 验证。
3. 同时冻存净化株，建立 Master Rescue Stock，避免重复净化成本。

倍增放缓的根因排查

传代周期由 24 h 延至 36 h，先测葡萄糖摄取率。若降至 50 % 以下，检查培养箱 CO? 浓度漂移；若正常，则跑β-半乳糖苷酶染色，阳性率 > 15 % 提示细胞进入应激衰老。此时加入 2 mM NMN 或 100 nM 雷帕霉素，可在 7 d 内把倍增时间拉回 27 h。

TEER 值突然下跌的修复

屏障功能下降常伴随 ZO-1 断裂。先做免疫荧光：若出现胞浆弥散，改用含 8 % dFBS + 550 nM 氢化可的松 + 250 μM CPT-cAMP 的强化培养基，48 h 内 TEER 可恢复 80 %。若仍无改善，考虑基质胶批次差异：换用 Corning® Matrigel® LDEV-free 批次，重新包被 0.4 μm 孔径插入式培养皿。

冻存复苏存活率骤降

复苏后贴壁率 < 70 %，优先检查 DMSO 批次纯度。劣质 DMSO 含 0.1 % 水分即可导致冰晶损伤。改用 99.9 % 色谱级 DMSO，并在复苏后 2 h 内加入 10 μM ROCK 抑制剂 Y-27632，存活率可拉升至 90 % 以上。

SV40 与 hTERT 表达失衡预警

qPCR 显示 Large T 升高、hTERT 下降，提示病毒启动子甲基化。使用 5-aza-2′-deoxycytidine 500 nM 处理 48 h，再用流式分选 eGFP 高表达群体，可获得表达比例重新平衡的亚克隆。

培养器皿静电吸附故障

某些品牌培养瓶内壁电荷不均，细胞易成团脱落。解决办法：

• 预铺 0.1 % 明胶 30 min，冲洗后接种。
• 若使用悬浮培养转瓶，加入 0.02 % 甲基纤维素减少剪切力。

年度深度保养清单

• 每 6 个月用 STR 鉴定复核，确认 42,XY 核型无漂移。
• 每年重建 Working Cell Bank，从 Master Bank 重新扩增不超过 5 代。
• 培养箱 HEPA 过滤器 12 个月更换一次；CO? 探头 6 个月两点校准，防止 pH 偏移带来假性衰老。