SV40 Large T 抗原的核定位密码

SV40 Large T 抗原携带两段核定位信号（NLS）：PKKKRKV 与 PAAKRV。进入胞浆后，importin-α/β 复合体识别 NLS，介导其穿越核孔。核内浓度在 2 h 内达到稳态，持续占据 p53 与 pRb 的 DNA 结合域，阻断细胞周期检查点。阻断效率通过 p21^Cip1 转录抑制率衡量，稳转株 p21 mRNA 水平下降 88 %。

pRb-E2F 通路的失活动力学

Large T 与 pRb 结合后形成 pRb-T 复合体，释放 E2F 转录因子。ChIP-seq 显示 E2F1 在 S 期启动子区富集指数从 0.7 提升至 6.4。细胞在 12 h 内完成 G1/S 过渡，倍增时间缩短 40 %。持续 E2F 活性通过 Cyclin A 表达水平监控，流式检测 Cyclin A 阳性率维持 93 % 以上。

p53 失活与端粒耗损延迟

Large T 通过 N 端结构域与 p53 结合，抑制其转录活性，但不影响蛋白水平。凋亡通路被阻断，caspase-3 激活率 < 2 %。端粒耗损速率由 50 bp/PD 降至 5 bp/PD，使得大鼠 BMEC 在 60 代仍保持 12 kb 端粒长度，Southern blot 显示单一条带无弥散。

紧密连接蛋白的表型维持

SV40 永生化不影响紧密连接表达。免疫荧光定量 ZO-1 线性指数 0.92，与原代 BMEC 无差异。TEER 曲线在 48 h 达到 280 Ω·cm2，渗透率对 70 kDa FITC-dextran 为 1.2 × 10?? cm/s，符合脑微血管内皮屏障标准。

外排转运体功能完整性

P-gp 活性通过 Rh123 外排实验验证，抑制剂 LY335979 将外排率从 79 % 降至 12 %。BCRP 功能由 pheophorbide A 外排实验确认，IC?? 1.8 μM。Western blot 显示 P-gp 与 BCRP 表达量与 P5 原代细胞差异 < 5 %。

批次一致性监控策略

每批次细胞需提交 RNA-seq 报告，SV40 Large T 表达量 CV < 3 %。差异基因火山图阈值设定 |log?FC| > 1 且 p < 0.01，确保无脱靶表达。差异基因数目控制在 30 个以内，且与血脑屏障功能无交集。

转化安全限界

Large T 在核内半衰期 48 h，持续表达依赖 CMV 启动子。通过四环素关闭系统验证，doxycycline 2 μg/mL 处理 72 h 后 Large T mRNA 降至 5 %，细胞周期恢复 p21 表达，证明可控性。动物实验禁止直接使用该细胞，需通过外泌体或上清间接研究。