细胞来源与初始状态

成年 C57BL/6 小鼠膀胱穹隆部上皮经胶原酶-胰酶两步消化，获得纯度 >95 % 的基底细胞层。原代细胞在常规培养条件下 6–8 代即出现生长停滞，β-gal 染色阳性率迅速升高。

SV40 早期区整合策略

使用第三代复制缺陷型 SV40 病毒，携带完整早期区（LT、ST、17KT）。MOI 0.3–0.5 可确保单拷贝插入，避免多拷贝导致的染色体不稳定。病毒经 VSV-G 假型化，感染效率在膀胱上皮可达 70 % 以上。整合位点集中在 Chr 4qD2–D3 区域，插入后 72 h 内 LT 蛋白开始高表达。

LT 抗原与细胞周期调控

LT 通过 LXCXE 基序结合 pRb 家族蛋白，释放 E2F 转录因子，推动 G1/S 转换。同时，LT-p53 结合域阻断 p53 的转录活性，抑制 p21WAF1/CIP1 表达，细胞逃逸衰老。ST 抗原进一步抑制 PP2A，激活 MAPK 与 PI3K-Akt 轴，提高增殖速率约 3 倍。

端粒稳态与永生化维持

SV40 转化细胞仍依赖端粒酶。实验表明，hTERT 表达水平在 30 代后下降 40 %，但 LT 激活 ALT 通路，APB 小体与端粒-circle DNA 形成，维持端粒长度 >8 kb。持续传代 100 代未见显著端粒缩短。

功能表型保留验证

• 尿斑蛋白 UPIa、UPIII 免疫荧光阳性率维持 90 % 以上
• TEER 值 900–1100 Ω·cm2，与原代细胞差异 <10 %
• 响应机械牵拉后 IL-6 分泌曲线与原代一致，提示炎症通路完整

基因组稳定性监测

每 10 代进行一次 CNV 芯片检测。常见插入位点附近 2 Mb 区域未发现 >100 kb 的缺失/重复。微核率 <0.2 %，符合 OECD TG 487 要求。STR 指纹保持与初始小鼠一致，排除交叉污染。

实验室应用提示

• 研究血-尿屏障：可在 12-well Transwell 上建立极化单层，监测 FITC-葡聚糖渗透
• 病毒感染模型：SV40 永生化细胞对腺病毒、慢病毒易感性高，适合基因编辑
• 药物毒性筛查：利用高内涵成像系统跟踪 24 h 内细胞周期动态，LT 荧光报告基因可作为增殖读值