细胞身份与基因背景

• 品系来源：8 周龄 C57BL/6J 雄性小鼠膀胱穹隆部上皮
• 永生化方式：慢病毒载体整合 hTERT-P2A-Neo 盒式结构，转录受 CMV 早期增强子/鸡 β-actin 复合启动子驱动
• 插入位点：Chr 7qE3（NCBI 登录号：PRJNA954672），单拷贝插入，无随机多拷贝引起的表达漂移

生长动力学与倍增曲线

• 群体倍增时间：22 ± 1.5 h（P20 代，完全培养基，37 ℃，5 % CO?）
• 饱和密度：4.2 × 10? cells/cm2（T-75 瓶，72 h 不换液）
• 极限传代：>100 代未见衰老相关 β-gal 阳性率 >5 %

培养基与添加剂

• 基础培养基：Keratinocyte-SFM（Gibco 17005042）
• 补充成分：
  • 25 μg/mL bovine pituitary extract
  • 0.2 ng/mL EGF
  • 1× ITS-X (insulin, transferrin, selenium, ethanolamine)
  • 0.5 μg/mL hydrocortisone
  • 100 U/mL penicillin + 100 μg/mL streptomycin
• 包被基质：0.1 % gelatin 预铺 30 min，室温风干即可

表面标志物谱

染色体核型

• 核型：40, XY（>95 % 细胞），hTERT 整合位点 FISH 显示单信号，无大片段缺失
• 微核率：<0.3 %，符合 OECD TG 487 体外遗传毒性标准

功能验证

• 屏障功能：TEER 值 800 ± 50 Ω·cm2（12-well Transwell，0.4 μm 孔径）
• 渗透系数：FITC-dextran 4 kDa P_app = 2.1 × 10?? cm/s
• 诱导炎症：LPS 1 μg/mL 刺激 6 h，IL-6 分泌量 18.7 ng/mL（ELISA）

运输与储存

• 形式：P15 冻存管，1 × 10? cells/mL，含 90 % FBS + 10 % DMSO
• 干冰运输：-78 ℃ 72 h 内签收
• 液氮储存：气相 -150 ℃，理论活性保持 >5 年

质量控制批放行标准

• 无菌检测：14 天培养无细菌、真菌生长
• 支原体 PCR：阴性
• 细胞活性：复苏 24 h 贴壁率 ≥90 %，台盼蓝拒染率 ≥95 %
• 基因稳定性：每 10 代 qPCR 验证 hTERT mRNA 表达量 CV < 5 %