在细胞生物学与皮肤相关研究领域，永生化犬真皮成纤维细胞 - SV40（Immortalized Canine Dermal Fibroblast - SV40）是一种极具价值的工具，以下为该细胞系的操作使用指南。

一、细胞培养条件

（一）培养基配制

该细胞系通常使用 DMEM 高糖培养基进行培养，需添加 10% 胎牛血清（FBS），以提供细胞生长所需的营养物质、激素和生长因子等，还需添加 1% 青霉素 - 链霉素双抗溶液，防止细胞培养过程中的细菌和真菌污染。

（二）培养环境

细胞培养应在 37℃、5% CO?的恒温培养箱中进行，这样的环境有助于维持培养基的 pH 值稳定，并为细胞提供适宜的生长温度和气体条件，以模拟体内生理环境，确保细胞的正常生长和代谢。

二、细胞传代操作

（一）传代比例

一般建议将细胞以 1:2 至 1:4 的比例进行传代培养。当细胞生长至覆盖培养瓶底面积的 80%-90% 时，即可进行传代操作，以防止细胞过度拥挤导致生长抑制和细胞状态下降。

（二）胰酶消化

使用 0.25% 的胰蛋白酶 - EDTA 溶液进行细胞消化。在消化过程中，需密切观察细胞形态变化，一般在 37℃下消化 1-3 分钟，待细胞间隙增大、细胞边缘变圆并开始从培养瓶壁上脱落时，立即加入含血清的培养基终止消化，轻轻吹打细胞使其完全脱落并形成均匀的细胞悬液，然后进行分瓶培养。

三、细胞冻存与复苏

（一）细胞冻存

1. 冻存培养基配制 ：冻存培养基一般由基础培养基、胎牛血清（FBS）和二甲基亚砜（DMSO）组成，比例为 90% FBS + 10% DMSO。
2. 冻存操作 ：将细胞收集并离心，弃去上清液，用冻存培养基重悬细胞，调整细胞密度至 5×10^6^-1×10^7^ cells/mL 左右，将细胞悬液分装于冻存管中，每管 1 mL。将冻存管置于程序降温盒中，放入 - 80℃冰箱中过夜，次日转移至液氮中长期保存。缓慢降温的过程有助于细胞逐渐适应低温环境，减少细胞内冰晶的形成，从而提高细胞复苏后的存活率。

（二）细胞复苏

1. 快速解冻 ：从液氮中取出冻存管，立即放入 37℃水浴中快速摇晃解冻，使细胞在 1 分钟左右完全解冻。
2. 细胞处理 ：将冻存管从水浴中取出后，用 70% 酒精消毒管外壁，移入无菌超净工作台内。将冻存管中的细胞悬液全部转移到含有 9 mL 完全培养基的离心管中，用移液管轻轻吹打混匀，使冻存管中的 DMSO 浓度稀释至 10% 以下，以减少 DMSO 对细胞的毒性作用。然后在 1000rpm 条件下离心 5 分钟，弃去上清液，加入适量完全培养基重悬细胞，将细胞接种于培养瓶中，放入 37℃、5% CO?培养箱中培养。

四、细胞基因改造机制

该细胞系是通过将 SV40 大 T 抗原基因导入犬真皮成纤维细胞而获得永生化。SV40 大 T 抗原能够与细胞内的多种蛋白质相互作用，其中包括视网膜母细胞瘤蛋白（RB）和 p53 蛋白。正常情况下，RB 蛋白通过与 E2F 转录因子结合，抑制细胞周期相关基因的转录，使细胞停滞在 G1 期，阻止细胞进入 S 期进行 DNA 复制，从而抑制细胞增殖。而 p53 蛋白则是一种重要的肿瘤抑制蛋白，在细胞受到 DNA 损伤等应激信号时，p53 蛋白可激活相关基因的表达，使细胞周期停滞，为 DNA 修复提供时间，若 DNA 损伤无法修复，p53 蛋白则会诱导细胞凋亡，以维持细胞基因组的稳定性。然而，SV40 大 T 抗原可以分别与 RB 蛋白和 p53 蛋白结合，使其失去正常的生理功能，细胞周期调控失效，细胞得以突破正常的增殖限制，实现无限增殖。

五、细胞应用

（一）皮肤修复研究

永生化犬真皮成纤维细胞 - SV40 是研究皮肤修复机制的重要细胞模型。成纤维细胞在皮肤损伤后的修复过程中发挥着关键作用，它们参与细胞外基质的合成与重塑，促进伤口愈合。通过使用该细胞系，可深入探究影响皮肤修复的各种因素，如细胞生长因子、信号通路等，为开发促进皮肤再生和修复的治疗方法提供理论基础。

（二）药物筛选

该细胞系可用于药物筛选，用于筛选能够调节细胞增殖、促进皮肤修复或改善皮肤相关疾病病理特征的药物。由于细胞具有永生化特性，可在较长时间内稳定地进行药物处理和实验观察，提高了药物筛选的效率和可靠性。