在神经科学研究领域，永生化大鼠脑微血管内皮细胞 - SV40（Immortalized Rat Brain Microvascular Endothelial Cells - SV40）是一种极具价值的细胞模型，为深入探究血脑屏障机制及相关疾病提供了有力支持。以下是关于该细胞系操作使用的详细指南。

一、细胞培养条件

（一）培养基配制

该细胞系通常使用内皮细胞专用培养基进行培养，如 ECM 基础培养基 +5% 胎牛血清（FBS）+ 内皮细胞生长添加剂。培养基中需添加青霉素 - 链霉素双抗溶液，防止细胞培养过程中的细菌和真菌污染。

（二）培养环境

细胞培养应在 37℃、5% CO?的恒温培养箱中进行，这样的环境有助于维持培养基的 pH 值稳定，并为细胞提供适宜的生长温度和气体条件，以模拟体内生理环境，确保细胞的正常生长和代谢。

二、细胞传代操作

（一）传代比例

一般建议将细胞以 1:2 至 1:3 的比例进行传代培养。当细胞生长至覆盖培养瓶底面积的 80%-90% 时，即可进行传代操作，以防止细胞过度拥挤导致生长抑制和细胞状态下降。

（二）胰酶消化

使用 0.25% 的胰蛋白酶 - EDTA 溶液进行细胞消化。在消化过程中，需密切观察细胞形态变化，一般在 37℃下消化 1-3 分钟，待细胞间隙增大、细胞边缘变圆并开始从培养瓶壁上脱落时，立即加入含血清的培养基终止消化，轻轻吹打细胞使其完全脱落并形成均匀的细胞悬液，然后进行分瓶培养。

三、细胞冻存与复苏

（一）细胞冻存

1. 冻存培养基配制 ：冻存培养基一般由基础培养基、胎牛血清（FBS）和二甲基亚砜（DMSO）组成，比例为 90% FBS + 10% DMSO。
2. 冻存操作 ：将细胞收集并离心，弃去上清液，用冻存培养基重悬细胞，调整细胞密度至 5×10^6^-1×10^7^ cells/mL 左右，将细胞悬液分装于冻存管中，每管 1 mL。将冻存管置于程序降温盒中，放入 - 80℃冰箱中过夜，次日转移至液氮中长期保存。缓慢降温的过程有助于细胞逐渐适应低温环境，减少细胞内冰晶的形成，从而提高细胞复苏后的存活率。

（二）细胞复苏

1. 快速解冻 ：从液氮中取出冻存管，立即放入 37℃水浴中快速摇晃解冻，使细胞在 45-90 秒内完全解冻。
2. 细胞处理 ：将冻存管从水浴中取出后，用 70% 酒精消毒管外壁，移入无菌超净工作台内。将冻存管中的细胞悬液全部转移到含有 9 mL 完全培养基的离心管中，用移液管轻轻吹打混匀，使冻存管中的 DMSO 浓度稀释至 10% 以下，以减少 DMSO 对细胞的毒性作用。然后在 1000rpm 条件下离心 3-5 分钟，弃去上清液，加入适量完全培养基重悬细胞，将细胞接种于培养瓶中，放入 37℃、5% CO?培养箱中培养。

四、细胞基因改造机制

该细胞系是通过将 SV40 大 T 抗原基因导入大鼠脑微血管内皮细胞而获得永生化。SV40 大 T 抗原能够与细胞内的多种蛋白质相互作用，其中包括视网膜母细胞瘤蛋白（RB）和 p53 蛋白。正常情况下，RB 蛋白通过与 E2F 转录因子结合，抑制细胞周期相关基因的转录，使细胞停滞在 G1 期，阻止细胞进入 S 期进行 DNA 复制，从而抑制细胞增殖。而 p53 蛋白则是一种重要的肿瘤抑制蛋白，在细胞受到 DNA 损伤等应激信号时，p53 蛋白可激活相关基因的表达，使细胞周期停滞，为 DNA 修复提供时间，若 DNA 损伤无法修复，p53 蛋白则会诱导细胞凋亡，以维持细胞基因组的稳定性。然而，SV40 大 T 抗原可以分别与 RB 蛋白和 p53 蛋白结合，使其失去正常的生理功能，细胞周期调控失效，细胞得以突破正常的增殖限制，实现无限增殖。

五、细胞应用

（一）血脑屏障机制研究

永生化大鼠脑微血管内皮细胞 - SV40 是研究血脑屏障机制的重要细胞模型。血脑屏障是由脑微血管内皮细胞、细胞外基质、周细胞和星形胶质细胞足突等组成的复合体，具有限制物质从血液进入大脑的作用，对维持中枢神经系统内环境的稳定至关重要。通过使用该细胞系，可深入探究血脑屏障的形成、维持以及在病理状态下的改变机制，如细胞间紧密连接的形成与调节、转运系统的功能等。

（二）药物渗透性测试

该细胞系可用于药物穿透血脑屏障的研究。在药物研发过程中，了解药物能否有效穿透血脑屏障是开发治疗中枢神经系统疾病药物的关键环节。将永生化大鼠脑微血管内皮细胞 - SV40 培养在特殊的实验装置中，如 Transwell 小室，模拟血脑屏障的结构和功能，然后将药物加入到上室，通过检测药物在下室的浓度变化，评估药物的渗透性，为筛选能够有效透过血脑屏障的药物提供实验依据。