永生化犬真皮成纤维细胞 - hTERT 是一种重要的细胞模型，以下是其操作使用方面的详细指南。

一、细胞培养条件

（一）培养基配制

该细胞系推荐使用 DMEM 高糖型培养基，其中添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素 - 链霉素双抗溶液。FBS 能为细胞生长提供必要的营养物质、激素和生长因子等，而双抗溶液则可有效防止细胞培养过程中的细菌和真菌污染。

（二）培养环境

细胞应在 37℃、5% CO?的恒温培养箱中培养。此环境有助于维持培养基的 pH 值稳定，同时为细胞提供适宜的生长温度和气体条件，使其 metabolic processes 运行更贴近体内生理环境，从而确保细胞正常生长和代谢。

二、细胞传代操作

（一）传代比例

建议将细胞以 1:3 至 1:4 的比例进行传代培养。当细胞生长至覆盖培养瓶底面积的 80% - 90% 时，即可进行传代，以避免细胞过度拥挤导致生长抑制和细胞状态下降。

（二）胰酶消化

使用 0.25% 的胰蛋白酶 - EDTA 溶液进行细胞消化。消化时，需密切观察细胞形态变化，一般在 37℃下消化 1 - 3 分钟，待细胞间隙增大、细胞边缘变圆并开始从培养瓶壁上脱落时，立即加入含血清的培养基终止消化。然后轻轻吹打细胞，使其完全脱落并形成均匀的细胞悬液，再进行分瓶培养。

三、细胞冻存与复苏

（一）细胞冻存

冻存培养基一般由基础培养基、胎牛血清（FBS）和二甲基亚砜（DMSO）组成，比例为 90% FBS + 10% DMSO。将细胞收集并离心，弃去上清液后，用冻存培养基重悬细胞，调整细胞密度至 5×10? - 1×10? cells/mL 左右，分装于冻存管中，每管 1 mL。将冻存管置于程序降温盒中，放入 - 80℃冰箱中过夜，次日转移至液氮中长期保存。缓慢降温有助于细胞逐渐适应低温环境，减少细胞内冰晶的形成，从而提高细胞复苏后的存活率。

（二）细胞复苏

从液氮中取出冻存管，立即放入 37℃水浴中快速摇晃解冻，使细胞在 1 分钟左右完全解冻。用 70% 酒精消毒管外壁后，移入无菌超净工作台内。将冻存管中的细胞悬液全部转移到含有 9 mL 完全培养基的离心管中，用移液管轻轻吹打混匀，使 DMSO 浓度稀释至 10% 以下，以降低其对细胞的毒性。接着在 1000rpm 条件下离心 5 分钟，弃去上清液，加入适量完全培养基重悬细胞，将细胞接种于培养瓶中，放入 37℃、5% CO?培养箱中培养。

四、细胞基因改造机制

该细胞系是通过将 hTERT 基因导入犬真皮成纤维细胞而获得永生化。正常细胞的分裂次数有限，这是因为每次细胞分裂时，染色体末端的端粒会缩短，当端粒缩短到一定程度时，细胞就会进入衰老状态并停止分裂。而 hTERT 基因是端粒酶的催化亚基，可使端粒延长，从而维持细胞的增殖能力，使细胞突破正常的增殖极限，实现无限增殖。

五、细胞应用

（一）皮肤修复研究

永生化犬真皮成纤维细胞 - hTERT 是研究皮肤修复机制的重要细胞模型。成纤维细胞在皮肤损伤后的修复过程中发挥关键作用，它们参与细胞外基质的合成与重塑，促进伤口愈合。利用该细胞系，可深入探究影响皮肤修复的各种因素，如细胞生长因子、信号通路等，为开发促进皮肤再生和修复的治疗方法提供理论基础。

（二）药物筛选

该细胞系可用于药物筛选，用于筛选能够调节细胞增殖、促进皮肤修复或改善皮肤相关疾病病理特征的药物。由于细胞具有永生化特性，可在较长时间内稳定地进行药物处理和实验观察，提高了药物筛选的效率和可靠性。