在细胞培养领域，永生化人胰腺间充质干细胞 - hTERT（Immortalized Human Pancreatic Mesenchymal Stem Cells - hTERT）是一种具有重要研究价值的细胞系。以下从多个方面详细介绍其操作使用要点：

细胞特性概览

这种细胞系是通过将人胰腺间充质干细胞与人端粒酶逆转录酶（hTERT）进行基因转导而获得永生化特性的。其具备以下关键特性：

• 永生化能力 ：引入 hTERT 基因后，细胞能够持续表达端粒酶，从而维持端粒长度，突破正常细胞的 Hayflick 极限，实现无限增殖，为长期实验提供稳定细胞来源。
• 干细胞属性保持 ：依然保留间充质干细胞的多向分化潜能，可分化为多种细胞类型，同时维持对胰腺组织再生修复的支持作用，这使其在糖尿病研究、胰腺组织工程以及再生医学研究等领域具有不可替代的地位。

培养环境搭建

• 培养基选择 ：常用的培养基为 PriGrow III 添加 10% 胎牛血清（FBS）以及 1% 青霉素 / 链霉素溶液。依据不同实验需求，也可采用含 10% FBS 和 1% 青霉素 / 链霉素的 DMEM/F12 培养基。
• 培养容器准备 ：推荐使用经处理的培养容器，如 PriCoat? T25 培养瓶或 Applied Cell 细胞外基质涂层培养瓶，这类容器能为细胞提供良好的附着表面，利于细胞生长与粘附。
• 培养环境条件 ：将培养瓶置于 37℃、5% CO? 的培养箱中培养，此环境有助于保持培养基 pH 值稳定以及细胞正常的新陈代谢。

冻存与复苏策略

• 冻存操作 ：采用含 10% DMSO 的完全培养基或专门冻存液作为冻存介质。将细胞悬浮液分装入冻存管，每管约 1×10? 个细胞。冻存过程可采用程序降温法，先置于 4℃ 30 分钟，再转移至 - 20℃ 30 分钟，最后放入液氮中长期保存；或利用冻存盒，置于 - 80℃冰箱过夜后转入液氮。
• 复苏流程 ：从液氮中取出冻存管，迅速置于 37℃水浴快速解冻，同时轻摇冻存管。解冻后，立即将细胞悬液转移至含适量预温完全培养基的离心管，吹打均匀后，以 125xg 离心 5 分钟。弃上清，用新鲜完全培养基重悬细胞，接种至预先准备的培养瓶，加入培养基，放入 37℃、5% CO? 培养箱继续培养。

传代操作规范

• 传代时机把控 ：当细胞在培养容器中的生长密度达到约 80% 时，便可进行传代。通常每周可传代 1 至 2 次，但具体频率需根据细胞生长状态和实验需求灵活调整。
• 传代具体步骤 ：先吸除旧培养基，用 PBS 润洗细胞以去除杂质。接着加入 0.25% 胰蛋白酶 - EDTA 溶液，在显微镜下观察，待大部分细胞脱落，立即加入等体积完全培养基终止胰蛋白酶作用。将细胞悬液转移至离心管，125xg 离心 5 分钟后，弃上清，用新鲜完全培养基重悬细胞沉淀，按 1:2 至 1:4 比例分装至新培养瓶，加入培养基后继续培养。

实验操作注意事项

• 无菌操作原则 ：在细胞培养的各个环节，包括培养、冻存、复苏和传代等，都必须严格遵循无菌操作，以防微生物污染，确保细胞健康生长。
• 细胞状态监测 ：定期观察细胞形态和生长状态，绘制生长曲线，及时发现并处理诸如污染、生长异常等问题。
• 培养基更换频率 ：依据细胞生长速度和实验需求，一般每 2 至 3 天更换一次培养基，以保证细胞获取充足营养，维持良好生长态势。