永生化人胰腺间充质干细胞 - Ras（Immortalized Human Pancreatic Mesenchymal Stem Cells - Ras）是一种具有重要研究价值的细胞系，以下是其详细的操作使用指南：

培养条件

• 培养基配置 ：常采用 DMEM/F12 培养基，添加 10% 胎牛血清（FBS）以及 1% 青霉素 - 链霉素溶液。也可根据具体实验需求，添加特定的生长因子和营养成分，如胰岛素、转铁蛋白等，以满足细胞的生长需求。
• 培养容器 ：推荐使用经特殊处理的培养容器，如 PriCoat? T25 培养瓶或 Applied Cell 细胞外基质涂层培养瓶，这些容器能为细胞提供良好的附着表面，有利于细胞的生长和粘附。
• 培养环境 ：将培养瓶置于 37℃、5% CO? 的培养箱中进行培养，湿度保持在 70%-80%，这样的环境有助于维持培养基的 pH 值和细胞的正常代谢。

冻存与复苏

• 冻存操作 ：使用含 10% DMSO 的完全培养基或专门的冻存液作为冻存介质。将细胞悬浮液分装于冻存管中，每管 1×10? 个细胞左右。冻存时，可采用程序降温法，先置于 4℃ 30 分钟，再转移至 - 20℃ 30 分钟，最后放入液氮中长期保存。也可使用冻存盒，将冻存管放入冻存盒中，放置 - 80℃冰箱过夜，之后转入液氮保存。
• 复苏流程 ：从液氮中取出冻存管，迅速放入 37℃水浴中快速解冻，同时轻轻摇动冻存管以加速解冻过程。解冻后的细胞悬液应立即转移至含有适量预温完全培养基的离心管中，轻轻吹打混匀后，以 125xg 的速度离心 5 分钟。弃去上清液，用新鲜的完全培养基重悬细胞沉淀，将细胞悬液接种到预先准备好的培养瓶中，加入适量的培养基，置于 37℃、5% CO? 的培养箱中培养。

传代操作

• 传代时机 ：当细胞在培养容器中的生长密度达到 80% 左右时，即可进行传代操作。一般来说，每周可进行 1 至 2 次传代，但具体的传代频率还需根据细胞的生长状态和实验需求进行调整。
• 传代步骤 ：首先吸除培养瓶中的旧培养基，加入适量的 PBS 润洗细胞，以去除残留的培养基和杂质。然后加入 0.25% 的胰蛋白酶 - EDTA 溶液，在显微镜下观察细胞，待细胞大部分脱落时，加入等体积的完全培养基终止胰蛋白酶的作用。将细胞悬液转移至离心管中，以 125xg 的速度离心 5 分钟，弃去上清液，用新鲜的完全培养基重悬细胞沉淀，按照 1:2 至 1:4 的比例将细胞悬液分装到新的培养瓶中，并加入适量的培养基，继续进行培养。

注意事项

• 无菌操作 ：在整个操作过程中，包括培养、冻存、复苏和传代等环节，都必须严格遵守无菌操作原则，以防止微生物的污染，确保细胞的健康生长。
• 细胞状态监测 ：定期观察细胞的形态和生长状态，记录细胞的生长曲线，及时发现并处理可能出现的问题，如细胞污染、生长异常等。
• 培养基更换 ：根据细胞的生长速度和实验需求，一般每 2 至 3 天更换一次培养基，以提供充足的营养物质，维持细胞的良好生长状态。