核心荧光染料与检测机制

Cell Proliferation EdU Image Kit (Orange Fluorescence) 的核心成分为 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）。EdU 是一种胸苷类似物，能够在 DNA 复制时期掺入新合成的基因组中。与传统 BrdU 检测法不同，EdU 通过铜催化的叠氮-炔烃环加成反应（Click Reaction）与荧光标记叠氮化物直接结合，无需抗原抗体结合步骤。这种化学反应具备高特异性，避免了抗体检测中常见的 DNA 变性处理，有效保持细胞形态完整性。橙色荧光（通常激发波长 550 nm/发射波长 570 nm）的发射光谱适用于多数荧光显微镜及流式细胞仪的主流滤光片配置。

灵敏度与线性检测范围

试剂盒的检测灵敏度通常可达到 1:10,000 的细胞掺入比例，即每 10,000 个细胞中至少有 1 个活跃分裂细胞可被识别。线性检测范围覆盖 0.1%-100% 的细胞增殖率，在标准曲线构建中 R2 值普遍高于 0.99。实际检测上限受限于显微镜 CCD 相机的动态范围，建议在 20%-80% 增殖率区间内进行定量分析以避免信号饱和。

光谱兼容性与多色标记方案

橙色荧光染料（如染料最大发射峰位于 570-580 nm）的光谱特性使其易于与蓝色核染料（DAPI）、绿色荧光蛋白（GFP）标记蛋白或红色细胞器探针（如线粒体深红染料）实现多色同步成像。需注意荧光通道间串扰问题，建议通过光谱拆分软件或设置单染料对照组进行补偿校正。典型配置建议：DAPI（通道一）、EdU-Orange（通道二）、FITC/GFP（通道三）、Cy5（通道四）。

细胞类型与处理时限

适用于贴壁细胞（如 HEK293、HeLa）、悬浮细胞（如 Jurkat 细胞）及原代细胞（如小鼠胚胎成纤维细胞）。EdU 标记时长通常为 2-24 小时，具体取决于细胞倍增时间：快速增殖细胞（如肿瘤细胞系）建议 2-6 小时，原代细胞建议延长至 12-24 小时。固定液需采用 4% 多聚甲醛（避免甲醇固定导致荧光淬灭），通透剂推荐使用 0.5% Triton X-100 作用 20 分钟。

试剂稳定性与保存条件

EdU 储存溶液（通常为 10 mM DMSO 溶液）需分装保存于 -20℃ 避光环境，避免反复冻融（建议单次使用 aliquot）。Click Reaction 缓冲液在 4℃ 条件下可稳定保存 3 个月，反应催化剂（铜盐溶液）需单独储存以防氧化。完整试剂盒有效期一般为 12 个月，批次间变异系数应小于 5%。

成像系统参数要求

适用于激光共聚焦显微镜、宽场荧光显微镜及高通量成像系统。推荐使用 20× 或 40× 物镜进行统计计数，60× 油镜用于形态学观察。建议相机量子效率（QE）在 570 nm 波段不低于 60%，若进行动态增殖追踪需配备活细胞培养系统（温度/CO? 控制）。

数据分析标准流程

原始图像需进行背景减法（基于无染料对照组），分割算法推荐采用 Otsu 自适应阈值或机器学习辅助核识别工具。增殖率计算公式：（EdU? 细胞数 / DAPI? 总细胞数）× 100%。统计学分析需至少重复 3 次独立实验，数据以均值 ± 标准差表示。