1. 全膜灰染

ECL发光后整张膜呈灰色，兔一抗浓度尚在推荐范围。问题出在封闭阶段脱脂奶粉结块，颗粒间隙成为二抗停车场。把奶粉过0.22 μm再配，封闭时间从1 h延长到2 h，灰度值直接腰斩。

2. 点状非特异

膜上随机分布黑点，直径0.5–1 mm，是A23720聚集颗粒。离心12000 rpm 5 min去掉聚合物，工作液里再添0.01 % Tween-20，黑点消失。离心后上清吸出来马上用，避免二次聚集。

3. 分子量错位条带

55 kDa位置出现两条相隔2 kDa的条带，一条目标一条未知。兔IgG轻链多态性导致二抗识别差异，把二抗预吸附兔轻链0.5 mg/mL，再按1:5000稀释，第二条带被拉平，单条带恢复。

4. 荧光通道串色

Alexa 488标记A23720与FITC标记一抗同时孵育，519 nm通道出现双面峰。原因是二抗过量，把稀释比例从1:2000降到1:5000，补偿值从15 %降到5 %，细胞分群立刻干净。

5. 组织切片边缘发亮

IHC边缘一圈亮环，核心信号弱。切片在湿盒里液体蒸发，边缘抗体浓度升高。用PAP笔圈住组织后，每100 mm2加200 μL抗体，湿盒底层加50 %甘油水，蒸发率降到2 %，光环消失。

6. 磷酸化条带消失

磷酸化蛋白分子量低，转膜0.22 μm PVDF已足够，但A23720稀释液里含0.05 % SDS，把膜孔冲大，小片段穿透。把SDS浓度降到0.01 %，甲醇从10 %提到15 %，磷酸化条带重新显现。

7. 内参突然弱化

β-actin信号一贯稳定，这次弱一半。新批号A23720浓度照旧，问题出在显影液放太久，HRP底物被氧化。显影液A/B各取5 mL新配，旧液倒掉，内参灰度瞬间回到老样子。

8. 高背景但条带清晰

背景灰但目标条带反差高，是封闭剂里的生物素与链霉亲和素系统交叉。把脱脂奶粉换成3 % BSA，生物素含量下降两个数量级，背景降到基线，信号噪声比提升3倍。

9. 反复strip后信号衰减

同一张膜strip三次，目标带越来越淡。Buffer pH 2.2把二抗轻链部分水解，残留片段占据结合位点。换pH 6.8温和 stripping液，55 °C 15 min，四次strip后信号仍保留85 %。

10. 工作液长菌发白

稀释后放4 °C一周，瓶壁出现白色絮状。菌体分泌蛋白酶切割抗体Fc，信号衰减50 %。加0.02 % ProClin 300抑菌，不换抗体，也能再稳用7天，避免频繁重配。