1. 开管先离心

原装1 mL液体在运输中震荡，管壁附着5 μL气溶胶。开盖前4 °C 12000 rpm离心2 min，把液体甩回底部，避免一开盖就损失5 %，浓度被动降低，后续条带莫名其妙变浅。

2. 稀释液配方微调

PBS-T加5 %脱脂奶粉是通用款，但小鼠IgG1亚型带弱正电，和聚苯乙烯膜非特异吸附高。把离子强度降到0.05 M，再加0.25 M甘氨酸，pH 7.6，背景黑点减少一半，信噪比肉眼可见提升。

3. 封闭温度与时长的反比

37 °C封闭1 h，奶粉里的生物素会解离，后续链霉亲和素系统出现灰色阴影。25 °C摇2 h或4 °C过夜，生物素保持完整，背景降到仪器基线。夏天室温超28 °C，直接把封闭罐塞进冷室，别让温度毁了抗体。

4. 一抗稀释先定型

二抗A23710亲和力常数Ka=1.5×10? M?1，平台结合只需30 min。先固定二抗1:5000，再把小鼠一抗从1:200到1:2000做3倍梯度，选第一条不糊的稀释度，再微调二抗1:3000–1:8000，10 min就能锁定最佳点，省掉盲目过夜。

5. 洗膜节奏

TBST每次5 min×3遍是底线，高背景时加到5遍，每遍换200 mL液体，体积低于100 mL游离二抗洗不掉。摇床转速调到80 rpm，液体能冲起膜角，表面张力破坏，游离抗体彻底剥离。

6. 显影液温度

ECL显影液从4 °C取出直接倒膜，信号强度比室温低20 %。把液体在25 °C水浴5 min再使用，膜面温度均匀，酶催化效率最高，胶片曝光1 s就能出条带，省掉反复压片。

7. 荧光版抗淬灭

Alexa 488标记A23710，封片剂甘油>80 %会慢淬灭。改用70 %甘油+0.5 % n-丙基没食子酸，荧光7天仍维持95 %。急着拍图却遇到淬灭，用0.5 %对苯二胺急救，信号能拉回90 %。

8. 旧膜二次利用

strip缓冲液pH 2.2会把二抗轻链部分水解，残留55 kDa鬼带。改用0.5 % SDS+0.1 M Tris-HCl pH 6.8+0.1 % β-ME，55 °C 15 min，鬼带消失，β-actin信号完整，一张膜跑两轮，节省样本。

9. 工作液回收上限

稀释成1:5000的工作液，4 °C存放72 h信号剩85 %。加0.02 % ProClin 300可延长到7天，但HRP标记会被抑制。折中：第一周用剩的做斑点封闭，第二周直接报废，不冒信号衰减风险。

10. 电子记录同步

每取一次微管，在ELN里扫码记录剩余数量，系统自动算半衰期。低于3管触发采购提醒，提前30天订货，价格锁定，避免临时下单遇到批次断档，项目节点稳稳当当。