1. 背景条带从哪来

WB 膜上一片灰，最常被忽略的是小鼠 IgG 污染。细胞上清里残留的小鼠单抗，在胶里电泳后分子量恰好落在 25–55 kDa，与山羊抗小鼠 IgG 二抗结合，形成“幽灵条带”。A21210 自带 HRP，信号放大后灰度值能冲到 40–60，与目标条带 80–120 重叠，肉眼难辨。

2. 封闭液升级：从 5% 脱脂奶到 10% 山羊血清

脱脂奶里含有牛 IgG，A21210 对其交叉 <1%，但奶中生物素会与 HRP 体系产生级联背景。把封闭液换成 10% 山羊血清，37 °C 封闭 45 min，背景灰度能降到 10 以下。血清需热灭活 56 °C 30 min，灭活补体，避免非特异结合。

3. 一抗稀释液加“竞争 IgG”

把纯化小鼠 IgG 干粉直接掺进一抗稀释液，终浓度 10 μg/mL。游离 IgG 抢占 A21210 的交叉位点，膜上残留的小鼠 IgG 被“稀释”成少数派，信号比从 1:1 拉到 1:20，背景条带肉眼消失。成本 2 元/片，比换超敏底物便宜 10 倍。

4. 二抗浓度“腰斩”实验

A21210 推荐 1:5000，出现背景时直接砍到 1:15000，4 °C 孵育过夜。低温减缓 HRP 酶促动力学，信噪比提升 2.3 倍。条带强度下降 15%，用 CCD 曝光 30 s 补回，不影响定量线性。室温孵育 1 h 的老办法在 1:15000 浓度下几乎无信号，温度是隐形变量。

5. 膜类型决定“救”还是“弃”

0.45 μm PVDF 孔径大，IgG 吸附更深，背景难降。换 0.2 μm NC 膜，背景灰度直接掉 30%，但小分子 <20 kDa 会穿膜。实验若检测 15 kDa 蛋白，改用 0.22 μm 尼龙膜，甲醇活化步骤省略，A21210 的 HRP 活性保留 98%，背景依旧低。

6. 底物选择：ECL vs 超敏

ECL 底物在 1 ng 目标条带时信噪比 3:1，超敏底物可到 10:1，但会把背景一起放大。背景灰度 20 以下用超敏，20 以上先用 ECL 把系统“洗”干净，再决定要不要升级。A21210 的 HRP 标记密度 1.2 mol/mol，足够驱动 ECL，无需额外浓缩。

7. 仪器参数：CCD 增益与像素合并

背景高时，把 CCD 增益从 10 降到 3，像素合并 2×2，曝光 60 s。信号积分不变，随机噪点下降 40%，背景条带被算法平滑掉。很多实验室只调曝光时间，忽略增益，结果把背景一起提亮。

8. 数据挽救：背景扣减的“红线”

ImageJ rolling ball 半径设 50 像素，能扣掉大部分背景，但半径 >75 会把目标条带削薄 10%。真背景来自 IgG 污染，扣减后仍残留 5% 假阳性。最佳做法是重做实验，而不是靠软件“美颜”。