开盖前先做三件事

A21020 到手先别急着稀释。离心30 s 把管壁液滴收到底部，涡旋3 s 让甘油分散均匀，再快速离心一次。这一步能把浓度误差拉到5% 以内，后续条带灰度重现性直接提升一个量级。

稀释液配方实测对比

PBS-T 加5% 脱脂奶是最常用体系，背景控制到0.05 AU 以下。做磷酸化蛋白把奶换成3% BSA，奶里自带碱性磷酸酶会把p-ERK 条带吃掉。荧光二抗体系直接上TBS-T，PBS 里钠离子会让Alexa 647 量子产率掉12%。HRP 系统想再省抗体，把Tween-20 降到0.02%，A21020 可以拉到1:25000，信号还能维持三倍信噪比。

incubation 时空参数

室温摇床60 min 是通用写法，膜厚大于0.45 μm 或者分子量大于150 kDa，把时间延长到90 min，让抗体充分渗进膜孔隙。4 ℃ 过夜并不会有更高信号，反而让背景荧光增加30%，原因是低温下非特异吸附更稳。真的需要过夜，把抗体浓度减半，封闭液里加0.5 M NaCl，能把静电吸附洗掉一半。

洗涤节奏决定背景

HRP 系统用PBS-T 洗三次，每次5 min，背景基本压到仪器底噪。荧光系统要升到四次，每次7 min，第三次开始换新的洗膜盒，避免盒壁残留的抗体重新沾回膜上。洗膜液量必须盖住膜至少三倍面积，50 mL 管只放一张7 cm×8 cm 膜，叠放等于人为提高背景。

信号放大与淬灭边界

A21020 HRP 做ECL，发光液滴到膜上30 s 内必须进暗盒，超时HRP 会把底物耗干，条带出现空心化。荧光系统里，Alexa 488 标记的A21020 在680 nm 激发下会串到Cy5 通道，多色成像时把曝光顺序调成Cy5→Cy3→488，减少激发交叉。膜别干透，一旦水分低于30%，荧光染料进入聚集态，量子产率腰斩，补救办法是用PBS 泡10 min 再成像，能拉回70% 信号。

剥离与重复利用

同一张膜要剥三次，用0.2 M NaOH 洗5 min，PBS 中和后重新封闭。HRP 版本的A21020 在剥离后残留小于2%，可以做磷酸化/总蛋白双循环。荧光版本剥离后染料碎片会黏在膜上，第三次背景升高到0.08 AU，建议换膜，别硬撑。

实验组对照排布

阴性对照用1× PBS 替代一抗，检测二抗自身背景；阳性对照用兔源GAPDH，保证转印效率；空白对照不加任何抗体，用来扣仪器噪声。三组对照灰度差值控制在0.02 AU 以内，实验数据才算干净。

故障速查表

• 条带整体发灰：洗膜时间不足，或者封闭液过期，换新的BSA
• 荧光条带空心：曝光太久，底物被耗干，缩短到30 s
• 高背景呈条纹状：膜叠放导致抗体残留，改用单张平铺洗膜
• 信号衰减快：发光液pH 掉到8 以下，换新鲜底物
• 荧光淬灭快：膜干透，重新水化再成像