为什么二抗决定Western成败

WB条带发虚、背景发灰、荧光淬灭快，90%的 troubleshoot 最终追到二抗。山羊抗小鼠IgG 是实验室用量最大的二抗，批次差一个字母，效价能掉三倍。A21010 这款货号在采购目录里出现频率极高，先把关键指标拆开看，再决定要不要下单。

先看宿主与交叉

A21010 宿主是山羊，免疫原为小鼠IgG 全分子，通过免疫亲和层析去掉山羊内源IgG，交叉反应谱系写得很干净：小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3 全部识别，不与兔、大鼠、人、牛血清反应。多色实验里同时孵兔抗大鼠的一抗，背景依旧干净，这一条就能省掉预吸附步骤。

标记方式怎么选

同样一个A21010，后缀带HRP、FITC、Alexa Fluor 488、647，价格阶梯能差四倍。HRP 做化学发光最稳，曝光三十秒就能拿到0.1 pg 条带；做荧光WB 直接上Alexa 647，680 nm 激发，红外背景低，膜可以反复剥离三次不掉信号。流式细胞仪有561 nm 激光就选PE，别省那几百块，FITC 通道串扰能把APC 信号吃掉20%。

效价与稀释度实测数据

厂家给WB 1:5000–1:10000，ELISA 1:10000–1:50000，这是PBS-T 里的理论值。把脱脂奶换成5% BSA，同样一张膜，1:15000 仍能拿到3 倍信噪比。做免疫荧光时，封闭液里加0.1% Tween-20，稀释到1:200 背景最干净，再往下走信号衰减比背景快，得不偿失。

批次间差异如何锁死

每批A21010 出厂带一张“实测COA”，里面给的是ELISA 效价。自己实验室建一个小库：同一批一抗、同一转印膜、同一曝光机，把新到批次的二抗跑一遍，灰度值落在旧批次±10% 就算合格，超了直接退货。冷链记录也要看，夏天常遇到37 ℃ 运输过夜，HRP 活性能掉一半，签收当天必须测酶活，别等用到月底才发现条带弱。

储存与分装细节

原瓶4 ℃ 只能放六周，反复开盖引入蛋白酶，HRP 信号三周腰斩。收到先离心5 min，把管壁液滴甩下来，按每次实验量分装到0.5 ml 低蛋白吸附管，-80 ℃ 直接速冻，避免-20 ℃ 冰晶反复。荧光标记品更要避光，铝箔纸包两层，冻融三次亮度掉15%，用完直接扔，别心疼。

实战避坑清单

1. 一抗小鼠来源，二抗却选“山羊抗小鼠IgM”，结果一张膜全空
2. 多色成像把A21010 Alexa 488 和山羊抗兔Cy3 混孵，两种染料电荷相近，互相淬灭，条带发虚
3. 封闭用奶粉含生物素，HRP-链霉亲和素系统直接爆表
4. 信号弱就盲目加二抗浓度，背景先爆表，条带反而被淹没
5. 膜晾干后再孵二抗，HRP 在干膜上失活，曝光五分钟啥也看不见

价格与渠道

国产分装版A21010 HRP 100 μL 最低报180 元，原装进口1 mL 要1200 元。看预算也看应用场景：发文章做回补实验，直接买原装，审稿人要求提供货号；内部筛选阶段用国产分装，提前做一批效价标定，数据一样稳。大宗采购签年度协议，每季度锁一次价，冻干粉的关税和运费能省8%。