1. 名称对号入座：避免把 GROγ 当成 GROβ

CXCL3 官方符号对应 GROγ，别名 MIP2-B、CINC2b。大鼠同源基因写作 CINC2b，序列与人 CXCL3 差 5 个氨基酸。抗体说明书若写 Anti-MIP2，先核对免疫原，是否覆盖 Val59-Leu70 这段 GROγ 独有 C 端，防止交叉识别 GROβ 导致条带重叠。

2. 样本类型：血清、血浆、细胞上清怎么选

健康人血浆 CXCL3 中位数 35 pg/mL，炎症状态下 200–3000 pg/mL。血清需凝固 30 min 后离心，避免纤维蛋白吸附损失 15% 抗原。细胞上清蛋白含量低，可直接上样；若用无血清培养，添加 0.1% BSA 防止肽段吸附管壁。

3. ELISA 关键步骤：把 100 μL 做成 75 μL

试剂盒默认 100 μL 样本，小鼠眼眶采血总量不足。把样本体积压到 75 μL，同步把标准品也调成 75 μL，曲线斜率不变，节省 25% 样本。板条预湿 300 μL 1×洗液 2 min，降低边缘效应，CV 从 8% 降到 4%。

4. 标准品溶解：一次分装杜绝反复冻融

冻干标准品用 0.5 mL 去离子水复溶，轻柔颠倒 10 次，避免涡旋产生泡沫。立刻按 50 μL/管分装，-80 ℃ 存 6 个月活性不变。实验前取一管室温 15 min 平衡，剩余丢弃，防止第二次冻融造成标准曲线漂移。

5. 洗板机设置：注液高度 3 mm，抽液角度 30°

注液针太高产生气泡，太低冲击包被抗体。设定 3 mm 高度，流量 250 μL/s，抽液角度 30°，残余体积 <2 μL/孔。洗板结束立即拍干，板面潮湿会稀释底物，TMB 显色变浅，低值样本出现假阴性。

6. 显色时间：肉眼判断 0.2 AU cutoff

TMB 室温反应 10 min 后，450 nm 读数 0.2 AU 对应 20 pg/mL，肉眼可见淡蓝。继续显色到 20 min，高值孔会过饱和，曲线顶部拉平。控制 10–12 min 内终止，线性区间最宽，数据无需二次稀释重跑。

7. 质量控制：两份外控锁定批次误差

自制低值 60 pg/mL、高值 800 pg/mL 质控血清，分装 200 μL/管，-80 ℃ 保存 1 年。每块板各放 2 孔，偏差 >15% 整板重做。外控与试剂盒自带质控同时记录，方便追踪是批次问题还是操作问题。

8. 数据导出：模板自动算浓度

用 Excel 模板录入 OD 值，四参数拟合自动生成 R2、CV、回收率，一键导出 PDF。手动抄录容易把小数点错位，导致 300 pg/mL 写成 30 pg/mL，审稿人质疑数据异常。模板加密码保护，防止误删公式。

9. 异常值排查：Hook 效应与基质效应

样本 CXCL3 > 4000 pg/mL 时，一步法可能出现前带抑制，读数回落到 200 pg/mL。预稀释 1∶10 再测，若结果×10 与初值差异 >20%，判定 Hook 阳性。脂血样本 3000 mg/dL TG 导致 OD 整体抬高，用 0.9% NaCl 替代稀释液做空白对照，扣除背景。

10. 实验收尾：板子封存与抗体保存

显色终止后 30 min 内读数，超时 OD 会下降。读完把板子贴膜放 4 ℃，可留 3 天复核。剩余抗体 2–8 ℃ 保存，加 0.02% NaN? 抑菌，避免反复拿取。每月用 0.22 μm 滤器通气 1 次，防止长霉污染整瓶抗体。