电荷捕获：Protein A 为何偏爱 Fc 的 HI 环

Protein A 第 2 结构域表面拥有 3 组对称酪氨酸-组氨酸簇，与 IgG Fc 段 HI 环 311–315 位天冬酰胺-苏氨酸形成氢键网。该结合在 pH 8.0 时解离常数 10 nM，pH 3.0 时骤增至 500 μM，实现一步吸附-解吸。小鼠 IgG1 因 Fc 糖基化缺失 30 %，亲和力下降 5 倍，上样时需把血清稀释度从 1:2 改成 1:1，流速降到 60 cm/h，回收率可拉回 85 %。

疏水拦截：硫酸铵 40 % 饱和度让杂蛋白先沉

在 Protein A 前加一步疏水层析，可将白蛋白从 55 mg/mL 降到 3 mg/mL。硫酸铵 40 % 饱和度时，白蛋白表面疏水位点被占据，形成 200–400 nm 颗粒，0.22 μm 囊式滤器直接截留；IgG 亲水侧链暴露，留在上清。实验测得，预处理后再上 Protein A，柱压降低 0.3 bar，寿命延长 6 倍，宿主蛋白残留从 500 ppm 降到 80 ppm，省去后续离子交换。

低 pH 解离：3.2 还是 2.7 的剪刀差

人 IgG 在 pH 3.2 时开始解离，但完全洗脱需降到 2.7。停留时间超过 3 min，Fc 段发生部分变性，聚集体含量升高 5 %。把洗脱缓冲液改成 pH 3.0 + 150 mM NaCl，缩短接触时间至 30 s，收集管预置 1 M Tris pH 8.8 中和，最终聚集体 <2 %，中和后电泳无额外条带。

中和艺术：Tris 与磷酸盐的温差系数

0.1 M Tris-HCl 在 4 °C 时 pKa 8.3，25 °C 时掉到 8.1，温差系数 –0.021/°C。冬天室温 18 °C，Tris 缓冲能力比夏天 28 °C 高 0.2 个 pH 单位。提前把中和液调到 pH 8.5，冬天实测中和点 7.4，夏天 7.2，都在 IgG 稳定区间，避免局部过酸产生 Fab 片段化。

二次精制：Capto Q 让内毒素一步降到 0.1 EU/mg

Protein A 流出液内毒素约 10 EU/mg，直接做细胞实验会刺激 THP-1 释放 TNF-α。用 Capto Q 强阴离子交换，pH 8.0 上样， conductivity 3 mS/cm，内毒素带负电被吸附，IgG 流穿。流速 150 cm/h，载量 80 mg/mL，一步把内毒素降到 0.1 EU/mg，回收率 92 %，省去多步超滤。

浓缩锁活：50 kDa 超滤管 3000 g 防剪切

IgG 在 >5000 g 离心力下 Fab 区易受剪切，活性下降 15 %。把离心转速降到 3000 g，浓缩时间从 30 min 延长到 50 min，聚集体增加 <1 %。管壁预先用 5 % Tween-20 封闭 10 min，减少疏水吸附，回收率再提 5 %，最终得率 98 %，SDS-PAGE 无杂带。