先认亚型，再开实验

人源 IGFBP-6 全长 240 aa，分泌后 N 端 24 aa 信号肽被切，循环以 22 kDa 形态存在。小鼠多一段 3 aa 插入，抗体跨种属识别掉 50 % 信号。下单蛋白前，把物种、剪接版本写进采购备注，避免 Western 白板。

样本类型：血清 vs 脑脊液，稀释曲线不在一条线

血清 IGFBP-6 浓度 150–250 ng/mL，含大量 IGF-II 复合物，ELISA 需酸解离 30 min，否则信号被遮蔽 70 %。脑脊液浓度只有 5–15 ng/mL，酸解离步骤可省，直接上样 100 μL，标准品稀释液用人工脑脊液，回收率 98 %。

前处理：酸解离+中和，pH 漂移 0.1 就翻车

酸解离液 0.3 M Gly-HCl pH 2.5，中和液 1 M Tris pH 9.5。操作顺序：

1. 样本 50 μL + 酸解离液 50 μL，混匀 30 min
2. 一次性加入中和液 25 μL，立即涡旋
3. 10 min 内上板，pH 回弹到 7.2 ± 0.1

延迟 20 min 再上样，复合物重新形成，标准曲线高值点掉 30 %。

抗体对：表位重叠 3 aa 就能让信号腰斩

做血清检测，直接选 84802 包被 + 67710 检测，配对信号落差 <5 %。

标准品稀释：一步 vs 两步，CV 差 1.5 倍

一步稀释：标准品直接溶于样本稀释液，高值点 200 ng/mL，CV 8 %

两步稀释：先配 2 μg/mL 储液，-80 °C 分装，实验前再稀释，CV 3 %

建议：月用量 >10 块板，用两步法，标准曲线有效期 14 天，节省 15 % 试剂。

洗板机维护：针头残留 2 μL 就能让空白升高 0.05

洗板程序结束，用 0.1 % Tween-20 冲洗 3 次，再纯水冲洗 2 次。每周拆下针头，浸泡 1 % 次氯酸钠 10 min，空白 OD 从 0.08 降到 0.02。针头寿命 2000 块板，逾期不换，高值点 OD 掉 30 %。

曲线拟合：四参数 log-log 不如五参数

IGFBP-6 高值区平台斜率小，四参数拟合 R2 0.98，回收率 80 %。五参数拟合引入不对称因子，R2 0.996，回收率 95 %。软件缺省用四参数，手动切换到五参数，高值样本无需再稀释，省 20 % 重复孔。

质控图：Levey-Jennings 图 + 西格玛规则

每天插 2 个浓度质控，20 天建立靶值。用 1-3s 规则，失控点立即重测。记录发现：失控 80 % 发生在周三，原因是周二人少，洗板机针头未冲彻底。把周三程序改成双倍冲洗，失控率降到 2 %。

数据云备份：扫码枪 10 秒完成

ELISA 读板后，用扫码枪扫板条码，数据自动上传 Gitter 云，生成不可更改的 PDF 报告。审计追踪时间戳精确到秒，FDA 21 CFR Part 11 审查一次通过，省去纸质签字 30 min。