35 kDa 的 Wnt 拮抗剂，参数表漏看一行，TOPFlash 信号就从 90 % 掉到 30 %。

1. 活性单位：IC50 ≤ 15 ng/ml 才算及格

• 用 Wnt3a conditioned medium 刺激 HEK293-TOPFlash，Dkk-1 梯度 0–200 ng/ml，拟合曲线 IC50 15 ng/ml 对应 150 IU/mg。
• 市面上写 50 ng/ml 的批次实际只有 45 IU/mg，一次实验要用 1 μg，成本翻 3 倍，直接索要原始拟合图，R2<0.98 直接退货。

2. 纯度与聚体：SDS 一条带只是门票

• Native-PAGE 出现 70 kDa 二聚体峰说明 Cys47 形成错配二硫键，受体 LRP6 结合 KD 从 0.8 nM 升到 12 nM。
• 要求 SEC-MALS 图谱，聚体峰面积 < 5 % 再签收，否则 TOPFlash 最大抑制率掉 25 %。

3. 标签位置：N-His? 遮不住活性，C-His? 遮不住纯化

• N 端 His? 距离 CRD1 结构域 18 ?，基本不影响 LRP6 结合；C 端 His? 靠近 Cys-rich 尾，金属螯合层析时咪唑会拉扯疏水核，活性回收 70 %。
• 无标签版本单价贵 20 %，比活性 200 IU/mg，做体内注射省得清除标签免疫原，算总账更划算。

4. 内毒素：0.05 EU/μg 是原代神经球天花板

• 0.1 EU/μg 的 Dkk-1 加入神经干细胞 48 h，Nestin? 球数目减少 30 %，不是 Wnt 被抑制，而是 LPS 背景毒。
• 要求 动态 LAL 曲线，上升斜率 > 0.02 OD·min?1 就退货，0.01 EU/μg 以下才能看到纯粹 Wnt 抑制。

5. 缓冲液盐度：50 mM Tris 让蛋白背对背

• 低盐 < 100 mM NaCl 时，Dkk-1 等电点 8.7 易形成可逆聚体，Native-PAGE 拖尾，活性 IC50 飘到 40 ng/ml。
• 出厂配方 PBS+150 mM NaCl+10 % 海藻糖 能把聚体压到 < 2 %，?80 °C 一年零损失。

6. 冻干 VS 液体：冻干活性 +15 %，运费 ?50 %

• 液体 ?80 °C 保存 12 个月活性掉 18 %，干冰运费每公斤 ￥200；冻干品 25 °C 避光 24 个月零损失，常温运输。
• 复溶用 15 °C 水浴 90 s，立即冰浴，TOPFlash 抑制率与新鲜液体平行，误差 < 4 %。

7. 标记度：Alexa 647 1:1 最稳

• 标记度 2 时 Lys134 被双标，LRP6 结合 KD 升到 20 nM，抑制率掉 35 %。
• 选标记度 1.0–1.2 且附 MALDI-TOF 图谱，多一个标记峰直接退货，活体成像信背比维持 10:1。

8. 批次日检：TOPFlash 快速标定

• 96 孔板模式，Wnt3a CM 50 μl + Dkk-1 50 ng/ml，Firefly 值应下降 75 %，Renilla 内参不变，CV<5 %。
• 偏差 > 10 % 立即启动售后，免费换新，实验节奏不停。