1. 样本采集：抗凝剂决定回收率

• EDTA 血浆：2 小时内离心 1500 g 10 min，纤维原缺失，VEGF-C 回收 96%
• 血清：凝固 30 min 后离心，血小板裂解释放 PDGF-BB，对 ELISA 无交叉，但浓度平均低 8%
• 鼻腔灌洗液：PBS 5 mL × 3 回吸，立即冰浴，24 h 内检测，避免淋巴管内皮细胞分泌后稀释

2. 预处理：去颗粒与浓缩

• 高速去碎片：12000 g 4 °C 15 min，去掉脱落细胞与黏液，降低背景 OD 0.02
• 超滤浓缩：10 kDa 截流，4 mL 样本→200 μL，浓缩 20 倍，LOD 从 15 pg/mL 降至 0.7 pg/mL，适合泪液等低丰度液体
• 冻存注意：?80 °C 分装，一次用一管，冻融 2 次浓度下降 12%

3. 试剂配制：校准品与缓冲液

• 标准曲线：7 点 0-2000 pg/mL，4-PL 拟合，r ≥0.995，零孔 CV<5%
• 稀释液：PBS + 0.1% BSA + 0.05% Tween-20，pH 7.2，降低管壁吸附 30%
• 底物：TMB 单组分 100 μL，室温避光，5 min 0.6 OD 为最佳线性段，超时继续显色误差翻倍

4. 加样与孵育：一次成型

• 包被板：抗人 VEGF-C 单克隆 2 μg/mL，100 μL/孔，4 °C 过夜，洗板 3 次拍干
• 样本体积：50 μL，复孔设计，边缘孔封空，降低蒸发梯度
• 孵育节奏：37 °C 1 h，振荡 400 rpm，保证抗原-抗体接触概率，信号提升 18%

5. 洗板与信号读取

• 洗板机参数：350 μL/孔，浸泡 30 s，循环 4 次，残留体积 <2 μL，背景 OD 控制在 0.04
• 读数双波长：450 nm 主读，630 nm 参比，带宽 10 nm，OD 线性 0-3.0
• 读取时机：终止液 50 μL 后 3 min 内完成，延迟 10 min 信号下降 8%

6. 数据分析：模板与质控

• 四参数拟合：Excel 模板 + GraphPad 宏，自动剔除 R2<0.99 的离群点
• 质控血浆：低 120 pg/mL，高 800 pg/mL，每板各 2 孔，CV ≤8% 视为合格
• 单位换算：1 ng/mL = 12.5 pmol/L，分子量 40 kDa，投稿前统一单位避免审稿人质疑

7. 故障速查表

8. 进阶应用

• 细胞分泌动力学：HMVEC 无血清培养，每 6 h 取样，200 μL，观察淋巴管生成刺激前后峰值
• 动物模型：小鼠血浆用量 15 μL，1:2 稀释，检测下限 7 pg/mL，足够覆盖基线 40 pg/mL
• 多重芯片：与 VEGF-A/Flt-1 共用，液相芯片平台，节省 60% 样本，适合药效筛选