1. 抗原架构：CD54 到底长什么样

• 胞外区：D1-D5 五个 Ig-like 结构，总长 453 aa，溶液中呈弯曲棒状，流体半径 6.4 nm
• 关键表位：D1 的 Glu37-Asp55 环，LFA-1 结合位点，90% 抗体对识别此段
• 脱落机制：金属蛋白酶 ADAM17 在 Ala480-Val481 切断，生成 85-90 kDa 可溶片段，血清半衰期 45 min

2. 双抗体夹心 ELISA 核心路线

1. 捕获抗体：克隆 84H10，小鼠 IgG2a，包被浓度 2 μg/mL，pH 9.6 碳酸盐缓冲液 4 °C 过夜
2. 检测抗体：生物素标记克隆 15.2，识别 D3 区，避免与捕获位点重叠，减少空间位阻
3. 信号链：Streptavidin-HRP 1:20000，TMB 底物 100 μL，450 nm 读取，线性范围 0.15-10 ng/mL

3. 化学发光升级方案

• 底物切换：SuperSignal Femto，发光信号提升 8 倍，LOD 降至 15 pg/mL
• 积分时间：0.2 s/孔，避免信号过曝，板间 CV 从 8% 压到 4%
• 全自动化：Tecan Fluent 脚本自带两点校准，漂移 <5%，适合 384 孔高通量

4. 磁微粒管式发光原理

• 微粒粒径：2.8 μm，表面羧基密度 0.3 mmol/g，包被量 12 μg Ab/mg 微粒
• 反应模式：液相悬浮，15 min 达到平衡，反应体积 100 μL，样本占比 20%
• 分离清洗：磁场强度 4000 G，3 s 完成固液分离，残留未结合物 <0.1%，背景 OD 降低 60%

5. 电化学发光夹心体系

• 电极表面：链霉亲和素包被金电极，面积 3 mm2，单次测量抗原结合量 0.5 pg
• 标记分子：Ru(bpy)?2?-抗体，激发电压 1.2 V，发光波长 620 nm，寿命 500 ns，可脉冲计数
• 优势：动态范围 4 个数量级，血清无需稀释即可覆盖 0.05-50 ng/mL，脓毒症峰值不溢出

6. 内源干扰与阻断

• 异嗜抗体：HAMA 阳性血清可造成假阳性 0.8 ng/mL，稀释液加入 50 μg/mL 小鼠 IgG，干扰降到背景水平
• 补体结合：C1q 与 ICAM-1 电荷互作，加入 0.15 M NaCl 与 5 mM EDTA，阻断补体级联
• 溶血影响：Hb > 2 g/L 时 OD 升高 0.03，样本溶血指数 ≥ 3 拒绝上机

7. 校准品与溯源链

• 国际标准：NIBSC 20/136，浓度 25 ng/ampoule，复溶后 ?80 °C 分装，6 个月内使用
• 校准间隔：每批试剂盒独立 6 点曲线，禁止跨批次套用，斜率偏差允许 ±10 %
• 质控血浆：低值 0.4 ng/mL，高值 4.2 ng/mL，每块板各 2 孔，CV ≤ 8 % 才算有效

8. 数据输出与解读

• 单位换算：1 ng/mL ≈ 12.5 pmol/L，分子量 90 kDa，文献常用 pg/mL，注意统一
• 临界值设定：健康人群 95% 上限 260 ng/mL，高于 400 ng/mL 提示血管内皮激活，可结合 IL-6 判断炎症程度
• 四参数拟合：R2 ≥ 0.995，低值端 0.15 ng/mL 回算偏差 ≤ 10 %，高值端 10 ng/mL 偏差 ≤ 5 %

9. 常见问题速排表