为什么名字里带“-3”却常被当成“唯一”

Galectin-3 是 galectin 家族里唯一的嵌合型成员，N 端携带胶原样重复序列，C 端保留经典的糖识别域（CRD）。这种双模块结构让它既能交联糖链，又能自身寡聚，形成多价晶格。实验里若把它当成普通凝集素对待，轻则背景高，重则信号倒挂。理解这条“结构红线”是选对抗体、选对抑制剂的第一步。

抗体选购：先问“表位”，再看“克隆”

1. 表位落在胶原样区还是 CRD？

• 胶原样区（aa 1–110）容易暴露，适合石蜡切片，但不同物种同源性低，跨种检测会掉信号。
• CRD 表位（aa 250–250）序列保守，人鼠交叉反应好，可做双标，但甲醛固定后可能被糖缀合物遮蔽，需要抗原修复。

2. 单抗还是多抗？

• 单抗：背景干净，适合流式、免疫共沉淀；注意供应商是否提供“定点突变阻断”验证数据，防止 CRD 里乳糖竞争实验出现假阴性。
• 多抗：信号放大能力强，适合低丰度样本；要求厂家出具“批次间差异报告”，看 OD 值波动是否＜8 %。

3. 偶联标记怎么选？

• 荧光：CRD 里含色氨酸，自发荧光在 350 nm 附近有拖尾；选 Alexa Fluor 488 或 647 可避开。
• HRP：糖基化位点 Asn-145 若被占用，酶标记会增大分子量，WB 条带迁移到 34 kDa 左右，跑胶时记得加阳性对照。

重组蛋白：糖基化、标签、内毒素三维卡尺

1. 表达体系决定糖谱

• HEK293：糖链以复杂型为主，最接近人源，适合细胞功能实验。
• E. coli：无糖基化，溶解度差，但 CRD 活性反而更高，适合晶体学。

2. 标签位置别乱放

• N-6×His 会掩蔽胶原样区，抑制纤维状寡聚；选 C-6×His 或 Strep-tagⅡ 更稳妥。
• 若做 BLI 或 SPR，要求厂家提供“标签切除”服务，避免 KD 值偏差一个数量级。

3. 内毒素 ≤ 0.1 EU/mg 是硬杠杆

Galectin-3 本身能激活 TLR4，内毒素再超标，巨噬细胞分泌 TNF-α 的 EC50 直接下掉 5 倍。索要 LAL 报告时，一定确认稀释度是否做过回收率实验，防止“伪低值”。

抑制剂：从乳糖到高级拟糖，先看“解离半衰期”

1. 天然配体

• 乳糖：KD ≈ 220 μM，细胞实验里 20 mM 才起效，渗透压已超标；只适合体外酶活。
• N-乙酰乳糖胺（LacNAc）：KD ≈ 12 μM，信号关闭效率提高一个量级，价格只贵 30 %。

2. 拟糖小分子

• TD139：CRD 选择性高，KD 0.36 μM，吸入给药的肺纤维化模型里口服生物利用度仍＜2 %；实验用 1 mg kg?1 腹腔注射即可看到 α-SMA 下调。
• GB1107：口服利用度 38 %，但厂家只提供盐型，需自己转成游离碱再做 DMSO 溶解，否则 200 μM 就出现沉淀。

3. 多价拮抗剂

• 树枝状 Gal-PEG：价数 8 时 IC50 降到 0.8 μM，却伴随 600 kDa 分子量，静脉注射会快速被肝截留；做局部给药（气道、腹腔）更经济。

质检：一条 WB 不够，三重验证才放行

1. 还原/非还原双轨 WB

还原条件下 Galectin-3 单体 29–31 kDa；非还原条件 90–100 kDa 处应出现三聚体带，缺失说明蛋白氧化或冻干过程出错。

2. 糖结合活性 ELISA

用 asialofetuin 包被板，抑制剂做竞争曲线，要求 R2 ≥ 0.99，IC50 与 COA 标注值误差＜15 %。

3. 细胞水平核移位

THP-1 细胞 100 ng mL?1 LPS 刺激 4 h，Galectin-3 应从胞浆转入胞核；抗体若识别不到核内条带，说明批次存在构象表位丢失。

储存与分装：别让“反复冻融”吃掉活性

• 重组蛋白：添加 10 % 海藻糖 + 0.05 % CHAPS，–80 °C 分装 50 μL/管，可耐受 5 次冻融，活性保留＞90 %。
• 抗体：加入 50 % 甘油后 –20 °C 存放，避免“冰箱无霜循环”反复升温；每次取用前 4 °C 离心 5 min，防止 IgG 聚合。
• 抑制剂：TD139 这类腙键化合物怕潮，放干燥器 + 充氮，称量差异＞2 % 就重新标定母液浓度。

常见翻车现场与急救方案

• 背景一片雾：多半是二抗交叉识别 galectin-3 自身寡聚体，换用 F(ab')? 片段立即解决。
• 流式双阳“假双高”：CRD 表位抗体与 Annexin V 竞争钙离子，改用不含 EDTA 的缓冲液即可。
• 抑制剂加完反而信号升高：乳糖浓度＞50 mM 会渗透裂解细胞，释放胞核 galectin-3，看似“上调”；把浓度降到 5 mM 以下，改用 LacNAc。

价格与渠道：把“每微克活性”算到小数点后两位

• 抗体：看“每 μg 可做 WB 次数”而非整支报价；优质单抗 1 μg 能出 25 次条带，折合 4 元/次，比便宜多抗更划算。
• 重组蛋白：用“活性单位”归一化，1 nmol 结合能力 50 % 的批次，单价 800 元其实比 600 元却只剩 30 % 活性的“便宜货”实惠。
• 抑制剂：TD139 每 1 mg 可完成 20 只小鼠 10 天给药，成本 120 元/只；若改用高价 GB1107，口服剂量减半，总成本反而降到 80 元/只。