1. 溶解 30 s 漩涡：别让粉末壁粘损失 8%

冻干 PIGF 呈薄膜状贴壁，直接加 1 mL 无菌水，漩涡 30 s，回收率 98%；静置 5 min 再颠倒混匀，可消除肉眼不可见的蛋白聚集体。跳过二次混匀步骤，SEC-HPLC 多出一个 12% 聚合峰，后续细胞实验 EC50 向右漂移 1.6 倍。

2. 分装 50 μL 管：铝箔封口挡住 320 nm 光降解

液体 PIGF 4 °C 放置 72 h 活性掉 20%。预先把 1 mL 母液按 50 μL/管分装，铝箔避光，?80 °C 速冻，6 个月内活性平台维持 95%。透明管直射日光 2 h，活性损失 35%，等于直接报废半管。

3. 稀释梯度：用 0.1% HSA 替代 PBS，低吸附同时稳态

塑料吸头对 PIGF 吸附率 12%，稀释液里补 0.1% 重组人血清白蛋白，可把回收率拉到 99%。做血管生成实验，梯度 0–200 ng/mL，每步 2 倍稀释，CV 控制在 5% 以内；去掉 HSA，低浓度点信号直接被管壁吃掉，曲线出现“断尾”。

4. 内皮铺板：4 × 10? cells/孔，提前 2 h 贴壁

HUVEC 第 4 代以内，4 × 10? cells/孔（96 孔板）2 h 贴壁率 90%，再补 PIGF 刺激，24 h 管腔分支数最清晰。细胞密度提到 6 × 10?，细胞间相互抑制，分支数反而下降 18%；低于 3 × 10?，孔壁裸露区域多，图像分析软件把背景算成管长，数据虚高。

5. 刺激时序：16 h 节点拍照片，避开凋亡窗口

PIGF 50 ng/mL 刺激 8 h 可见初步网格，16 h 管腔完整且凋亡率 <5%，拖到 24 h 细胞开始回缩，管腔断裂，软件读数出现假阴性。固定用 4% PFA 室温 15 min，PBS 洗 3 次，再存放 48 h 内拍照，分支点变异系数 <6%。

6. 抗体阻断：anti-Flt-1 10 μg/mL 做阳性对照

验证特异性时，提前 30 min 加 10 μg/mL anti-Flt-1，PIGF 诱导的管腔长度被砍掉 85%，背景无影响。浓度降到 5 μg/mL，抑制率只剩 40%，容易误判为非特异性作用。

7. 读板参数：9 点聚焦，Object size 50–500 μm

高内涵成像仪 4× 物镜，每孔 9 点均匀采样，Object size 设 50–500 μm，可排除细胞碎片。阈值 Sensitivity 45、Threshold BG 15，保存模板，下次实验直接调用，板间 CV 从 12% 压到 7%。