1. 为什么选 OPN 做表面标记？

OPN（Osteopontin，基因名 SPP1）并非传统膜蛋白，它靠外泌体锚定和膜受体整合素 αvβ3/CD44 实现“临时驻留”。流式细胞术里把 OPN 当胞外抗原，用抗人 OPN-APC 抗体就能在 15 min 内完成表面染色，无需破膜。这种“可溶但可捕获”的特性，让 OPN 成为循环肿瘤细胞（CTC）和肿瘤相关外泌体双通道捕获的稀有标记。

2. 抗体-荧光耦合的化学计量

R&D Systems 的货号 IC1433A 采用 1:1 摩尔比 NHS-ester 标记，每个 IgG 分子带 2.7 个 APC 荧光团。流式仪器检测时，APC 的 ε 值 7×10? M?1cm?1 保证 100 个 OPN 分子就能产生 ≥50 MESF 的信号，信噪比 30:1，足以把 EpCAM? 的乳腺癌 CTC 从 10? 白细胞里筛出来。

3. 微球捕获的“三明治”结构

Miltenyi 的 OPN Exosome Isolation Kit 把抗 OPN 抗体共价偶联到 0.5 μm 聚苯乙烯微球。微球表面羧基密度 300 nmol/mg，抗体包被量 15 μg/mg，形成 50 nm 的抗体刷。外泌体膜上的 OPN 抗原表位与微球抗体结合后，再用 CD63-PE 二次标记，实现“外泌体-OPN-微球”三元复合物，回收率 85%，纯度 92%，比超速离心少 3 个数量级的共沉淀蛋白。

4. 单细胞测序的“活/死”质检阀

10x Genomics 官方协议把 OPN 加到 Cell Surface Protein panel。因为 OPN 在凋亡细胞表面会 10 倍上调，利用 Feature Barcode 技术，把 OPN-抗体-Oligo 标签读数 ≥10 UMI 的细胞标记为“濒死”，直接从下游分析剔除。这样可把线粒体基因比例从 25% 压到 5%，Seurat 的聚类 silhouette 系数提高 0.18，显著减少假亚群。

5. 实验室自建试剂的关键步

自己偶联抗体时，pH 8.5 的 0.1 M 碳酸氢钠缓冲液最稳；APC 染料先加 2 倍摩尔过量，避光 8 °C 反应 45 min；再用 1 M Tris 终止。脱盐柱选 7 kDa 截留，回收率能维持 90%。别用 BSA 封闭，OPN 会非特异粘附；改用 0.5% PEG-20000，背景降一个 log。

6. 仪器参数校准模板

BD FACSAria III 配置 633 nm 激光，APC 检测器 660/20 nm，每天先用 SpheroTech RCP-30-5A 六峰彩虹微球做 PMT 电压标定，把 3 μm 峰 MFI 定在 5×103。OPN 弱表达样本用 70 μm 喷嘴，鞘液压力 20 psi，事件率 ≤5 000 events/s，避免 coincidence 造成的假阳性。

7. 数据补偿的“死区”策略

OPC 实验常同时染 CD45-FITC、EpCAM-PE 和 OPN-APC。FITC 与 APC 重叠 2.3%，PE 与 APC 重叠 18%。先做单染管，把 APC 通道的 PE 溢出系数设为 18.2%，再跑补偿微球。OPN 弱阳性群落在 APC 200–600 区间，必须把补偿误差压到 ±0.3%，否则 2% 的 EpCAM? 细胞会误判为 OPN?。

8. 常见故障与现场排查

• 信号断崖式下跌：先换激光延时 30 s，检查 633 nm 功率是否掉到 20 mW 以下。
• 背景飙升：多半是抗体聚集，0.22 μm 过滤后 10 000 g 离心 5 min 即可。
• 分选后细胞不贴壁：鞘液 pH 偏低，用 1 M HEPES 把缓冲液调到 pH 7.4，再补 2 mM EDTA 防聚集。

9. 与 RNA scope 的联合验证

对分选后的 OPN?/CD45? CTC，立刻用 4% PFA 固定，RNA scope Multiplex v2 探针 Hs-SPP1-C2 标记。单细胞 RNA FISH 显示 87% 的 OPN 蛋白阳性细胞同步高表达 SPP1 mRNA（斑点 ≥5），证明流式信号与转录本一致性高，排除抗体交叉反应。