细胞培养上清、肿瘤组织匀浆、EDTA 血浆，三种基质的 CXCL9 浓度跨度 50–8000 pg/mL，同一块 ELISA 板却常出现高值跳水、低值抬头的失控曲线。把近两年的项目台账拆开，归纳七个高频踩坑点，每一步给出可复制的补救方案，数据不过发表门槛的情况基本清零。

1. 基质干扰：肝素使 CXCL9 回收率跌到 65 %

• 肝素与 CXCL9 的 GAG 结合域形成复合物，抗体表位被遮蔽
• 现场补救：样本用 PBS-1 % BSA 稀释 1:2，回收率拉回 95 %
• 长期方案：采集管换成 EDTA-K2，干扰直接消失，成本只高 5 %

2. 溶血误升高：Hb 0.5 mg/mL 让 OD 虚高 30 %

• 溶血释放血红蛋白，过氧化物酶底物被非特异催化
• 在 450 nm 同步读 570 nm 参比，ΔOD=OD450?OD570，背景砍掉 80 %
• 样本采集后 2 h 内离心 3000 g×10 min，溶血率从 8 % 降到 1 %

3. 标准品失活：?20 °C 反复冻融 5 次浓度掉 18 %

• CXCL9 含两对二硫键，冻融过程形成聚集体，抗体识别下降
• 收到标准品立即分装 50 μL/管，一次用完，禁止回冻
• 每管加 0.02 % Tween-20 防止吸附，回收率稳定在 98 % 左右

4. 洗板残留：每孔 20 μL 残液让低值段抬高 15 %

• 自动洗板机洗头堵塞，残液量用电子天平称，>2 mg 即 20 μL
• 立即拆洗头，10 % 次氯酸钠超声 15 min，通量恢复
• 把残液量写进日检表，超限当天更换洗头，曲线立即回归

5. 孵育温度：37 °C 90 min 信号翻倍，背景也翻倍

• CXCL9 检测抗体为鼠 IgG，37 °C 加速非特异结合
• 改回室温 22 °C 孵育 120 min，信噪比从 2.1 提升到 4.8
• 夏季实验室空调失效时，把板放 20 °C 恒温金属浴，误差可控在 5 %

6. 高值钩状效应：15000 pg/mL 样本读成 3000 pg/mL

• 一步法 ELISA 在抗原过量时形成“抗原-抗体-抗原”夹心空壳，OD 反而下降
• 现场稀释 1:10 重测，真实浓度 14800 pg/mL，回收率 99 %
• 在 SOP 里写明“目测 OD<1.0 但临床预期高值，必须预稀释”，避免返工

7. 板间差失控：边缘孔 CV 飙到 18 %

• 外圈 36 孔蒸发量 5 μL，导致浓度升高、CV 放大
• 采用“外圈填弃液”策略，A1-H1 列填 PBS，样本放中心 60 孔
• 每块板加 2 个中心质控，CV>10 % 整块报废，数据一致性直接过审计