1. 样本前处理：脂血 + 结合蛋白双重封印

雌二醇 98 % 与 SHBG、白蛋白结合，竞争法只测游离部分。

释放策略：

• 稀释液含 0.1 % 吐温-20 + 0.5 % 8-苯胺-1-萘磺酸（ANS），pH 7.4，室温 10 min 把结合型拉到游离侧，回收率 96 %。
• TG > 5 mmol/L 浊度 400 NTU，高速离心 10 000 ×g 10 min 去乳糜，背景 OD 降 0.015。

2. 加样顺序：一次加完才是竞争法灵魂

50 μL 样本 + 50 μL 酶标抗原 + 50 μL 抗体，同步加入，减少游离抗原提前占位。

枪头策略：

• 使用低吸附滤芯枪头，10 μL 残留体积 < 0.1 μL，避免高值样本被提前稀释。
• 反向加样：先加抗体，再加样本，最后加酶标抗原，可让低值区 OD 再抬 0.02，灵敏度逼近 5 pg/mL。

3. 孵育节奏：25 ℃ 慢温 vs 37 ℃ 快温

• 37 ℃ 30 min 信号高 15 %，背景也高 0.02，CV 从 4 % 升到 7 %。
• 25 ℃ 60 min，金属浴盖板压顶，蒸发率 < 2 %，整板 CV 压到 3 %，适合多中心比对。

4. 洗板机校准：喷嘴偏移 0.2 mm=残液 10 μL

残液量每增加 5 μL，TMB 背景高 0.01 OD，低值 10 pg/mL 样本被掩盖。

月检：

• 用 0.1 % 酚红溶液空洗，收集残液测 OD 550，换算体积 ≤ 2 μL/孔。
• 喷嘴堵塞用 0.5 mm 通针，再 70 % 乙醇超声 10 min，流量恢复 95 % 以上。

5. 信号读取：动力学斜率法取代单点读数

竞争法高值区 OD 0.1–0.2，轻微时差就能让 100 pg/mL 样本掉到 70 pg/mL。

改动力学：

• 加入 TMB 后 37 ℃ 读 650 nm 斜率 5 min，取线性区 Vmax，批内 CV 从 8 % 降到 3 %。
• 提前终止：斜率与硫酸终止法 R2 > 0.99，再切到斜率 routine，省 1 步加酸，废液量减半。

6. 标准曲线：4PL 负斜率+稀释因子双变量

公式：

y = ((A-D)/(1+(x/C)^B)) + D

A=OD 零孔，D=OD 最大，B=斜率因子 0.8–1.0，C=IC50。

样本稀释 1∶10 已写在曲线里，报告时直接乘 10，避免 Excel 手滑乘错 100。

7. 干扰排除：HAMA 与生物素“双杀”场景

• 类风湿因子 600 IU/mL 把 OD 抬高 0.03，换算假阳性 8 pg/mL，加 0.5 % HBR 后回到本底。
• 血清生物素 > 50 ng/mL（美发口服常见）抢占 SA 位点，信号被“中和”，稀释 1∶4 再测，回收率 93 %。

8. 异常值追凶：钩状效应藏在 2000 pg/mL

高剂量 hook 在雌二醇试剂盒里出现概率 0.3 %，样本浓度 > 2000 pg/mL 时，竞争复合物被过剩抗原撑开，OD 反而掉到 500 pg/mL 水平。

识别：

• 每块板随机挑 2 个高值样本做 1∶10 稀释，回算值偏差 > 20 % 即送钩状复检。
• 稀释液必须含 5 % 正常马血清，补充缺失基质，避免稀释后信号假性偏低。

9. 数据输出：把 Excel 模板写成 E2 方言

内置公式：

• =IF((Ave_OD-Blank)/(Max_OD-Blank)<0.05,"<10 pg/mL",LOGEST(...))
• 自动标黄 R2<0.98 的曲线，标红回收率 90–110 % 以外的样本，审核人一眼定位问题孔。
• 原始 OD、环境温度、试剂批号、操作者缩写四列锁定，审计追踪直接打印，省得 FDA 483 表找上门。