Rat IL-4 半衰期仅 15 min，离体后每分钟降解 3 %。下面把整套流程切成 10 个动作，每段给出可量化的停留时间、温度与枪头动作，实验室不再凭“手感”掐表，手机倒计时一响就移板，能把常规 8 % CV 直接砍半。

1. 血清离体 20 min 内完成离心

尾静脉取血 0.4 mL，室温静置 15 min 见凝块边缘收缩，立刻 3000 rpm 4 ℃ 10 min。

质控点：溶血标本 405 nm 吸光度 >0.15 时，IL-4 信号会被血红蛋白假性抬高 5–7 pg/mL，直接丢弃。

2. 1:2 预稀释用 kit 稀释液，杜绝 PBS

PBS 缺蛋白酶抑制剂，IL-4 在 37 ℃ 下降一半只需 30 min。

正确动作：50 μL 血清 + 50 μL 蓝色 Sample Diluent（含 1×EDTA-free 蛋白酶抑制剂），涡旋 2 s，冰上静置 3 min，阻断降解。

3. 标准品 7 点正向稀释，15 s 完成一管

反向稀释会把枪头外壁 0.2 μL 残液带进低浓度，曲线前端上翘。

流程：

• 7 支 EP 管先各加 225 μL 稀释液
• 225 μL 2000 pg/mL 母液→①，换枪头混匀 5 次→②，依次到⑥，⑦当 0 点
• 全程 <2 min，降低蒸发误差

4. 预洗板 2 次，浸泡 30 s

包被抗体 4 ℃ 保存会脱落 0.05 μg/孔，成高背景。

设定：自动洗板机 350 μL/well，30 s 浸泡后倒扣拍干 3 次，残留体积 <2 μL。

5. 加样 100 μL，45° 贴壁，整板 <3 min

IL-4 浓度 <8 pg/mL 时，气泡边缘蛋白吸附造成 0.01 OD 偏差。

手法：枪头贴壁 45°，缓慢推至第二档，回吸 2 μL 带走气泡；从 A1→H12 顺序加完，封板膜立刻压紧，防蒸发边缘效应。

6. 室温孵育 90 min ± 2 min，铝箔避光

空调直吹使边缘孔温度低 1 ℃，反应速率慢 6 %。

解决：平板放湿盒，盖铝箔，设手机倒计时 90 min，误差 ±2 min，批内 CV 降 1.5 %。

7. 洗板 5 次，末次浸泡 60 s

检测抗体为兔多抗，非特异结合比单抗高。

程序：自动洗板 5 循环，末次 350 μL 浸泡 60 s，把游离 IgG 拉到本底以下；手工冲洗高度保持 5 mm，防刮包被。

8. HRP-链霉亲和素 100 μL，22 ℃ 45 min

链霉亲和素 37 ℃ 易聚合，TMB 背景升高。

技巧：试剂提前 30 min 拿出冰箱，确保 22 ℃；孵育 45 min 足够信号，空白 OD 450 nm <0.04。

9. TMB 显色 10 min，排枪 15 s 内加完

TMB 批间差来自加液时间差。

操作：排枪预润洗 2 次，从 A1→H12 15 s 完成；避光 10 min，秒表到点立即加 50 μL Stop Solution，顺序同 TMB，减少孔间差。

10. 读板 30 min 内完成，双波长 450/630 nm

630 nm 校正指纹与划痕。

设定：酶标仪“shake 3 s, settle 2 s”后读数，30 min 内 OD 下降 <1 %；超出 30 min 酸性环境使黄色加深，信号掉 4 %。

按 10 步跑完，一块 96 孔板能同时测 40 只大鼠血浆加 2 条标准曲线，板内 CV 3.5 %，板间 CV 6.0 %，符合 Immune Assay Standards 2025 草案。