VEGF-A 的氨基酸长度从 121 到 206 不等，市面上所有 Mouse VEGF ELISA Kit 几乎都以 VEGF165 为校准骨架。同一批血清样本，用识别 165 的盒子测出 400 pg/mL，换 120 kit 可能只剩 120 pg/mL。把技术参数拆成 7 个维度，每个维度给出实测边界值，以后拿到 COA 直接对号入座，10 min 就能判断这支盒子能否匹配你的样本类型。

1. 捕获抗体表位：114–126 区段是黄金坐标

晶体结构显示 VEGF165 的受体结合域在 114–126 位氨基酸。

验证方法：

• 说明书“Immunogen”若写“recombinant mouse VEGF164 (aa 114–126)”或“VEGF-A (K123-R140)”，说明表位覆盖受体结合域，检测的是生物活性形式。
• 出现“VEGF120 full length”或“VEGF188 N-term”直接跳过，肿瘤组织里 120 亚型高，结果会虚高 30 %–50 %。

2. 标准品分子量：39 kDa 还是 42 kDa 决定换算系数

VEGF165 糖基化后 42 kDa，非糖基化 39 kDa。

关键参数：

• COA 里“Molecular mass of calibrator”写 39 kDa，代表 E.coli 表达，无翻译后修饰；写 42 kDa 则是 CHO 真核表达，更接近血清天然形态。
• 做肿瘤匀浆选 42 kDa，做细胞上清或基因敲除验证选 39 kDa，批间差更小。

3. 检测限与功能灵敏度：0.9 pg/mL 只是理论值

厂商把 2 倍空白标准差当检测限（LOD），实际样本里基质背景能把 LOD 抬高 3 倍。

实测步骤：

• 取 6 只 C57BL/6 小鼠基础血清，各 100 μL，加 3 个浓度标准品（2、5、10 pg/mL）做回收。回收率 80–120 % 的最低浓度才是“功能灵敏度”。
• 功能灵敏度 ≤5 pg/mL 的盒子才够测正常小鼠血浆，高于 10 pg/mL 只能测肿瘤或缺血模型。

4. Hook 效应上限：30 000 pg/mL 是红线

VEGF 过表达质粒转染 48 h 后，细胞上清浓度能冲到 25 000 pg/mL。

参数判读：

• 说明书“Upper limit of quantification (Hook)”≥30 000 pg/mL，代表抗体亲和足够，高剂量不会假低。
• 若只写 10 000 pg/mL，肿瘤裂解液必须预稀释 1:5，否则落在 Hook 区，结果比真值低 40 %。

5. 亚型交叉矩阵：120、164、188 各占多少？

VEGF-A 基因外显子 6 和 7 剪接差异产生 120、164、188 三个主要亚型。

交叉率表格：

6. 回收与稀释线性：1:2 和 1:8 都要过关

小鼠血清含脂蛋白颗粒，容易把 VEGF 包埋。

合格线：

• 加入 100、1000、4000 pg/mL 标准品，回收率 90–110 %。
• 1:2、1:4、1:8 三个稀释比，线性相关系数 r≥0.99，斜率 0.9–1.1。

满足两项指标，说明稀释液里已含解离剂，无需额外加 0.1 % Tween-20。

7. 批间差与加速稳定性：37 °C 7 天偏差 <8 %

VEGF 标准品含肝素稳定剂，但糖基化位点仍易氧化。

质控技巧：

• COA 附“Accelerated stability test”：37 °C 7 天，标准曲线 ED50 偏差 <8 %。
• 无此项数据的批次，到货立即分装 –20 °C，避免反复冻融导致标准品降 15 %。

8. 技术参数速查表（贴实验台）

把 7 项指标全部打钩再下单，基本能把肿瘤匀浆、缺血视网膜、细胞上清三种样本一次性测准。