01 把 IL-2 当成“细胞扩增油门”，先踩对点

IL-2 别名 TCGF、T cell growth factor，浓度 50 pg/mL 就能让 CD25? T 细胞进入 S 期。

小鼠血清静息值 3–8 pg/mL，ConA 刺激 24 h 后冲到 800–1 200 pg/mL，动态窗口 200 倍。

实验目的不同，采样窗口完全不同：

• 做免疫激活曲线：刺激后 6 h、12 h、24 h、48 h 各取一次，画四象限折线。
• 做药物抑制率：只抓 24 h 单点，减少动物使用量 50 %。

先把时间轴画在实验记录本首页，后面所有操作围绕这张表排程。

02 标准品梯度：7 点还是 9 点，取决于你打算投稿的期刊

Mouse IL-2 ELISA Kit 官方标曲 15.6–1 000 pg/mL，7 点。

想投 JI 需要 R2≥0.998，把两端再拉一个点：7.8 pg/mL 与 2 000 pg/mL，变成 9 点。

• 高浓度点用 2 000 pg/mL 可以早期发现 Hook 效应，省得样本稀释后再回头。
• 低浓度点 7.8 pg/mL 能把 LLOQ 压到 10 pg/mL 以下，符合 FDA bioassay 指南。

提前把 9 点梯度表存成 Excel 模板，打印贴到通风橱，移液时直接打钩，杜绝跳孔。

03 样本采集：抗凝剂、采血量、离心加速度三步定生死

• 肝素锂血浆 IL-2 回收率 105 %，EDTA-K? 回收率 88 %，枸橼酸钠只有 72 %。
• 采血量 200 μL 足够，但尾静脉取血常溶血；改用颌下静脉，溶血率从 5 % 降到 0.8 %。
• 离心 1 500 g 10 min 能去掉 99 % 血小板，IL-2 不会被吸附损失；升到 3 000 g 反而让血小板破裂释放蛋白酶，活性下降 12 %。

把这三步写进动物实验申请表，IACUC 审查一次过。

04 稀释线性陷阱：1:2 与 1:4 回收率能差 20 %

细胞上清里存在可溶性 IL-2Rα，形成复合物，稀释后解离，导致“越稀释越高”的假线性。

• 先用 1 M 甘氨酸-HCl pH 3.5 酸处理 10 min，再中和，回收率 95 %–105 %。
• 血清样本不存在这个问题，可直接 1:2 稀释，省一步操作。

在原始记录里加一行“是否酸处理”， reviewers 追问也能秒回。

05 洗板机校准：把背景压到 0.04 OD 的硬参数

• 洗板机注液体积 350 μL/孔，针速 5 档，残留体积 < 2 μL，背景能稳在 0.04。
• 洗液里加 0.05 % Tween-20 足够；升到 0.1 % 会剥脱抗体，信号降 15 %。
• 每天首板前跑一次“酚红法”：加满洗液，洗 5 遍后测 492 nm，OD ≤ 0.02 才算合格。

把酚红试剂放在洗板机旁，贴张 QR 码，手机扫码自动记录，审计官直点头。

06 读数窗口：15 min 内不上机，信号掉 8 %

TMB 显色终止后 630 nm 参比波长会随时间漂移。

• 终止后 3–5 min 读数最佳，OD 值高 0.02–0.03。
• 若板子多，用 384 孔板型读数仪，全板扫完 90 s，信号损失 < 1 %。
• 数据直接导出 .csv，避免手动誊写，把转录错误降到 0。

把读数仪电脑时间同步到 NTP，每板文件名带时间戳，后期追踪到秒。

07 曲线拟合：四参数 log 与五参数到底选谁

• 四参数拟合 EC50 落在 150–200 pg/mL 区间，R2 0.996，足够发 3 分文章。
• 五参数能修正上下平台不对称，R2 拉到 0.999，高区信号不塌肩，适合做药代动力。
• 用 GraphPad Prism 把两种拟合都跑一遍，AICc 差值 > 10 才选五参数，差值小就用四参数，省版面。