实验前环境稳态

GM-CSF 在血清中极易吸附塑料，室温静置 30 min 损失 8 %。操作台提前用 5 % BSA-PBS 封闭 10 min，风干后再摆放微孔板，可把非特异吸附降到 1 % 以下。空调设定 22 °C ± 1 °C，湿度 40–50 %，防止高湿导致冷凝水稀释标准品。

试剂回温与混匀

冻干标准品含载体蛋白 HSA，37 °C 快速回温会诱发聚合。步骤：室温静置 20 min，再轻弹 15 次，确认无可见颗粒。捕获抗体对剪切敏感，回温后 4000 rpm 瞬时离心 5 s，可减少气泡导致的批间 CV。

加样顺序与枪头管理

样本梯度跨越 7.8–1000 pg/mL，先加标准品后加高值血清，避免气溶胶污染低孔。使用低吸附滤芯枪头，反向移液，残留体积 < 0.2 μL。每次更换浓度，枪头务必丢弃，防止交叉污染导致假阳性。

孵育动力学与板盖选择

37 °C 湿盒孵育 90 min 达到 95 % 平衡。若实验室夜间温控波动，改用铝箔热封膜，边缘压紧，温度均匀性 ±0.4 °C。高海拔低气压环境，显色时间延长 10 %，软件内设自动修正系数，无需人工计时。

洗板机参数校准

GM-CSF 检测对残液极度敏感，洗板机残留 2 μL 即可使空白 OD 升至 0.06。设置：洗液量 350 μL/孔，浸泡 30 s，吸液高度 1 mm，重复 4 次。每日首板加 300 μL 纯水测试，重量法测残液 < 1 μL，方可继续实验。

显色终点判断

TMB 底物在室温 20 °C 线性期为 10 min，第 11 min 进入指数上升。酶标仪启用动态监测，每 30 s 读一次，450 nm OD≥2.0 立即加终止液。手动判断误差 ±15 s，动态模式可把 CV 压到 3 % 以内。

标准曲线拟合策略

四参数 Logistic 在 7.8–15.6 pg/mL 区间出现“钩状”回弯，改用五参数 Logistic，引入不对称因子 0.88，拟合残差由 ±6 % 降至 ±2 %。软件输出自动标记置信区间，满足 FDA 21 CFR Part 11 电子签名要求。

高值样本稀释验证

化疗后血清 GM-CSF 可高达 8000 pg/mL，超出上限。预实验按 1:2、1:4、1:8 稀释，回收率 90–110 % 方可接受。使用试剂盒自带样本稀释液，含 0.1 % Tween-20 + 5 % BSA，可减少基质效应；若用 PBS 替代，回收率下降至 70 %。

报告模板与单位转换

报告单默认单位 pg/mL，可一键切换至 ng/L。参考区间：健康成人血清 0–40 pg/mL；>150 pg/mL 提示急性炎症。模板内置自动判读，红色字体输出风险等级，减少临床医生二次计算时间。

现场常见问题速解

• 边缘效应：使用框架条填充空位，湿盒底层加水 100 mL
• 气泡干扰：加样后 200 g 离心 30 s，自动破泡
• 复孔离散：检查洗板机针头是否堵塞，用 0.1 % SDS 通针 5 min