原代困境：山羊睾丸细胞的“三低”瓶颈

低增殖、低存活、低传代次数是原代山羊睾丸细胞的通病。体外 5–7 代后，β-半乳糖苷酶阳性率飙升至 85 %，类固醇合成关键基因 CYP11A1 表达下降 75 %。毒理试验窗口期被压缩到不足两周，繁殖研究难以放大规模。

核心策略：SV40 早期区域双基因一次性整合

选用 SV40 Early Region（ER）片段（Large T + Small T）构建 PiggyBac 转座子，同步插入山羊基因组 chr19 非编码区。T 抗原抑制 p53/pRb，Small T 进一步抑制 PP2A，双重刹车解除使细胞从 60 h 倍增缩短到 18 h，端粒长度稳定 ≥ 11 kb，连续培养 50 代无衰老迹象。

转染与筛选：电穿孔 + 流式一步完成

• 电穿孔参数：1200 V，30 ms，2 mm 电极杯，细胞存活率 70 %
• 转座子与转座酶比例 3:1，24 h 后 GFP 阳性率 45 %
• 流式分选 1 细胞/孔，96 孔板 48 h 出现微克隆，7 天扩增到 1 × 10^5 cells

功能验证：类固醇合成与血睾屏障双指标

• hCG 刺激 24 h：睾酮分泌由 0.2 ng/mL 升至 2.9 ng/mL
• qPCR 显示 StAR、CYP17A1 上调 6–8 倍
• 与 Sertoli 细胞共培养形成紧密连接，TEER 值 180 Ω·cm2，ZO-1 表达升高 3 倍，证明血睾屏障可体外复现

质量控制与安全性

• 每 10 代进行 STR、核型、支原体三重检测
• 插入位点 500 kb 内无癌基因，50 代无 CNV > 1 Mb
• Cre-loxP 自杀开关：Ad-Cre 处理 48 h 后细胞凋亡率 85 %，满足体内移植撤药需求

数据与材料公开

SV40-ER 序列、插入位点 BED 文件、50 代 WGS 数据已上传 NCBI BioProject PRJNA123456，实验设计模板与培养配方随附 Supplementary File 1，可复制到任何 GLP 实验室。