细胞来源与遗传背景

分离自 6 月龄萨能奶山羊睾丸曲细精管上皮，原代贴壁生长 4 代即出现衰老标志 β-gal 阳性率 >80 %。SV40T 通过慢病毒载体 pLVX-EF1α-SV40T-Puro 单拷贝整合至 chr19:43,215,678 位点，Southern blot 显示单一条带，无游离质粒残留。STR 鉴定 16 个位点与山羊基因组 100 % 匹配，排除牛、绵羊交叉污染。

生长动力学

• 倍增时间：18.4 ± 0.9 h（37 °C，5 % CO?）
• 饱和密度：2.1 × 10? cells/cm2
• 克隆形成率：软琼脂 0 %，成瘤实验阴性
• 端粒长度：TRF 检测稳定在 11.2 kb（P20）

表型与功能标记

基因组稳定性

• 核型：60,XY（山羊二倍体）
• 拷贝数变异：WGS 显示 <0.02 /Mb，无关键基因缺失
• SNP 负荷：P25 代内 <0.1 /Mb

培养与保存条件

• 完全培养基：DMEM/F12 + 10 % FBS + 1 % NEAA + 1 % P/S
• 传代比例：1:4，0.25 % Trypsin-EDTA 消化 60 s
• 冻存液：90 % FBS + 10 % DMSO，程序降温盒 -1 °C/min
• 复苏存活率：95 ± 2 %

功能验证

• 睾酮合成：hCG 刺激 24 h 后培养液睾酮浓度由 0.3 ng/mL 升至 2.6 ng/mL（ELISA）
• 类固醇生成酶：CYP11A1、CYP17A1、STAR 表达上调 4–6 倍（qPCR）
• 精子发生体外诱导：与山羊 Sertoli 细胞共培养 72 h 形成类曲细精管结构

质控放行标准

每批次必检：支原体 qPCR 阴性、细菌真菌 14 d 无菌、SV40T 表达量 ≥ 对照 90 %、复苏 24 h 贴壁率 ≥ 93 %。