培养箱微环境的三条铁律

温度漂移 ±0.5 °C 就会使倍增时间从 24 h 拉到 30 h。每月用校准级温度计抽检 6 个位点，偏差 > 0.2 °C 立即报修。CO? 浓度每偏离 1 %，pH 波动 0.1，镜下可见细胞边缘卷边。湿度低于 90 % 会触发培养基蒸发，渗透压上升 30 mOsm/kg，细胞立刻皱缩。把一瓶 500 mL 无菌水放进培养箱底部，每周更换一次，可稳态维持湿度 95 %。

血清批号验证的极简方案

新批次血清到货后，用 96 孔板做 48 h 生长曲线。接种密度 3000 cells/孔，旧血清作对照，读值 R2>0.98 且倍增时间差异 <5 % 才能入库。若差异 >10 %，直接退货并记录批号，避免同一坑踩两次。

支原体哨兵系统

每周一固定抽 1 mL 培养上清，MycoSEQ qPCR 30 min 出结果。Ct>35 安全，Ct 30–35 黄色预警，立刻加 5 μg/mL Plasmocin 处理 3 天。Ct<30 红色警报，细胞封存，培养箱全面酒精-紫外联合消杀。年度统计表明，提前预警可把污染率压到 1 % 以下。

胰酶消化时长的“秒表+手感”双保险

SV40T 叶状肿瘤细胞极易过度消化。0.25 % Trypsin-EDTA 33 °C 预热，镜下观察细胞边缘开始回缩即刻加 2 mL 培养基终止。手心轻拍瓶壁出现“沙粒”感即为最佳脱落点。过度消化会导致核膜破裂，48 h 内出现多核巨细胞，后续实验全部作废。

冻存库位管理

液氮罐最上层温度波动最大，-130 °C 以上区域不做长期存储。把早期代次（P3–P5）放在中层，实验用中期（P6–P10）放在下层。每个冻存盒贴二维码，扫码即可调出 STR、支原体、复苏存活率记录，避免“盲盒”式找细胞。

细胞形态“红黄牌”识别

• 黄牌：细胞拉长、伪足减少 → 检查血清批号或 CO? 浓度
• 红牌：胞质空泡 >30 % 或颗粒状黑褐色沉积 → 疑似细菌或酵母污染，整瓶丢弃
• 黑牌：核多形性、染色体桥 → 立即封存、核型复查，防止异常克隆扩散

设备月检小清单

实验中断的紧急预案

培养箱故障 2 小时内无法恢复，把细胞瓶用 37 °C 预热培养基包裹，放入 30 °C 培养箱临时缓降代谢。超过 6 小时仍未恢复，直接复苏备份冻存管，确保实验不延期。