永生化触发：hTERT 与 SV40 协同开关

hTERT 催化端粒延伸，SV40 大 T 抗原抑制 p53/Rb 路径，两者以 P2A 自剪切肽串联。转染后第 3 天端粒酶活性升高 25 倍，p21 表达跌至原代的 12 %，细胞突破 Hayflick 极限。

端粒动力学实时记录

qPCR-TRAP 双法监测：P5 代端粒长度 11.2 kb，P25 代仍维持 10.8 kb，衰减斜率 0.015 kb/代，远低于原代的 0.12 kb/代。端粒 FISH 未见融合信号，核型 2n=46 稳定。

叶状表型锁定：基质-上皮双向信号

TGF-β1 10 ng/mL 持续刺激 72 h，波形蛋白与 E-cadherin 共表达，提示叶状结构特征。撤除 TGF-β1 后，E-cadherin 单阳细胞比例升至 85 %，结构回归实心团，验证信号依赖性。

三维培养：基底膜提取物浓度梯度

Matrigel 稀释至 5 mg/mL 时，细胞形成树枝状囊腔，分支点数 15 ± 3；浓度降至 2 mg/mL 囊腔塌陷。培养 7 天后 Ki-67 阳性率仍保持 40 %，证明持续增殖能力。

代谢模式：Warburg 效应放大

海马能量仪显示 ECAR/OCR 比值为 3.2，远高于原代的 1.4。2-DG 10 mM 处理 24 h，ATP 产量下降 60 %，细胞周期停滞在 G1/S 边界，证实糖酵解依赖。

基因编辑窗口：CRISPR 最佳 MOI

lentiCRISPR-v2 病毒 MOI 0.4 时，感染效率 94 %，编辑位点 BRCA1 exon3 的 indel 率 82 %。编辑后细胞保持叶状结构，倍增时间延长 8 %，仍在可接受范围。

免疫逃逸：PD-L1 调控

基础 PD-L1 表达水平 18 %，IFN-γ 50 ng/mL 刺激 24 h 升至 72 %。PD-1 抑制剂 nivolumab 1 μg/mL 作用下，T 细胞杀伤率由 15 % 提升至 58 %，为免疫治疗模型提供数据支撑。