污染哨兵：每周支原体 qPCR 巡检

培养第 3、6、9 天各取 200 μL 上清，16S rRNA qPCR Ct ≥ 35 才算安全。Ct 34–32 区间属于灰区，立刻用 BM-Cyclin 处理一代并复检。Ct < 32 直接整瓶销毁，防止 hTERT 序列被支原体核酸干扰导致表达漂移。

培养基疲劳信号：乳酸阈值与颜色拐点

DMEM 低糖 + 5 % FBS 体系下，培养 48 h 乳酸浓度 ≥ 12 mM 时细胞开始空泡化。把 FBS 提升到 8 % 或添加 1 mM 丙酮酸钠，可把乳酸峰值压到 8 mM，维持 α-SMA 纤维束完整。颜色由橙红转暗紫即视为疲劳信号，及时换液可避免不可逆收缩力下降。

传代节奏：胰酶时间窗与接触抑制

0.05 % 胰酶 + 0.02 % EDTA 消化 90 s 是黄金窗口。超时 30 s 就会让 hTERT 启动子甲基化升高 15 %，倍增时间由 28 h 拉长到 38 h。接触抑制密度为 2.5 × 10? cells/cm2，超过此值细胞会自发凋亡，瓶底出现片状脱落。

冻存复活：DMSO 浓度梯度测试

常规 10 % DMSO 冻存液对平滑肌细胞毒性偏大，复苏存活率 72 %。降到 7 % DMSO + 3 % PEG400 后存活率升至 88 %，且 α-SMA 表达量无变化。程序降温盒务必填充 250 mL 异丙醇，保证 -1 ℃/min 线性降温，否则端粒长度缩短 0.5 kb。

收缩功能维护：胶原凝胶与 ROCK 抑制剂

三维胶原凝胶 (2 mg/mL) 中培养 48 h，细胞保持长梭形且自发收缩。ROCK 抑制剂 Y-27632 (5 μM) 能抑制过度收缩导致的细胞脱离，48 h 后撤除即可恢复钙离子激动收缩实验灵敏度 (EC?? 0.8 μM)。长期添加会降低 α-SMA 表达 20 %，需间歇使用。

交叉污染排查：STR 指纹季度抽检

每 3 个月做一次 20 位点 STR，任意位点偏移 > 2 bp 即视为交叉污染。常见污染源为人源 HeLa 与 HTB-9，两者共享 D5S818 异常峰。发现污染立即启动备份株，原株封存。

设备校准：CO? 与湿度漂移对 pH 的连锁影响

CO? 浓度漂移 ± 1 % 会把 pH 从 7.35 推到 7.20，细胞开始卷边。每月用 Fyrite 气体分析仪校准一次，湿度 < 85 % 时托盘补水至 150 mL，防止培养基蒸发导致渗透压升高 30 mOsm，触发凋亡。

事故记录：电子台账与追踪码

建立电子台账，记录每瓶细胞的传代次数、冻存日期、复苏存活率与污染检测结果。每批次贴唯一条码，扫码即可查看完整履历，方便在下游实验出现表型漂移时精准回溯。