双基因协同永生化设计

SV40大T抗原封闭p53/Rb检查点，hTERT持续延伸端粒。二者通过P2A自剪切肽构建单开放读码框，摩尔表达比锁定1∶1。该比例下细胞在P30代端粒长度仍维持12–15 kb，与原代差距<5%，避免危机期凋亡。

启动子组合：CAG与Tet-On 3G的双重保险

CAG启动子驱动SV40-hTERT基础表达，Tet-On 3G系统接入可诱导关闭。加入100 ng/mL多西环素，48 h内hTERT mRNA下降>95%，细胞进入生长停滞。该开关用于研究血管生成基因时排除永生化背景干扰。

微血管表型维护：剪切力与基质胶

生理层流剪切力12 dyn/cm2连续作用24 h，细胞排列指数（orientation index）由0.25升至0.85，接近体内状态。基质胶浓度3 mg/mL时管腔形成完整，降至1 mg/mL出现断裂。剪切力缺失48 h，VE-cadherin膜定位消失30%，提示表型漂移。

代谢重编程：糖酵解与OXPHOS实时监测

海马力细胞能量仪显示，永生化细胞糖酵解潜能（ECAR）比原代高1.8倍，ATP生成依赖线粒体呼吸比例降至42%。添加2-DG 5 mM后增殖率下降55%，证实其依赖糖酵解维持快速增殖。

基因编辑效率：CRISPR-Cas9最佳窗口

MOI 0.3的lentiCas9-Blast感染48 h后，嘌呤霉素筛选3天即可>97%阳性。编辑位点选择内源Tie2基因外显子3，sgRNA spacer 20 nt GC含量55%，插入/缺失效率达78%。编辑后细胞保持微血管屏障功能，TEER值仅下降8%。

免疫逃逸检测：MHC I表达与NK杀伤

永生化后MHC I表达量下调至原代的35%，NK细胞杀伤率升至45%。补回IFN-γ 100 U/mL可恢复MHC I至70%，NK杀伤率降至20%。该特性用于构建同种异体移植血管化模型。

体外屏障功能：FITC-dextran渗透系数

标准检测采用4 kDa FITC-dextran，37 ℃ 90 min后基底侧荧光强度<5%视为合格。永生化细胞渗透系数（Papp）1.2×10?? cm/s，与原代差距<10%，符合BBB体外模型替代标准。

冻存复苏端粒检测

冻存液配方：90% K-SR + 10% DMSO，程序降温-1 ℃/min。复苏24 h后qPCR检测端粒长度，数据需落在12–15 kb区间，偏差>1.5 kb视为批次异常，整批下架。