拿到就能写进合同附件的硬核数字。
品系编号 MCEC-HPV16e6e7,来源于 8 周龄 C57BL/6 雌鼠左心室微血管段。原代分离后流式鉴定:CD31? 97.3 %,CD34? 2.1 %,LYVE-1? 99 %,排除淋巴管污染。HPV-16 E6/E7 通过整合缺陷型慢病毒递送,嘌呤霉素 2 μg mL?1 筛选 5 d,单克隆扩增至 P10 建库。
全基因组测序显示单拷贝插入 11B5 区段,物理坐标 chr11:95,421,770–95,425,970,距 Ets1 基因 18 kb。插入片段 4.2 kb,含 E6-IRES-E7-P2A-BlastR-WPRE。Southern 杂交 4.2 kb 单一条带,确认无多拷贝或随机重排。批次间插入位点漂移>100 kb 即判为不合格。
37 ℃、5 % CO?、低氧 5 % O?、EGM-2MV 完全培养基。P6–P20 倍增时间 18 ± 1 h;P25 起延长至 24 h。培养基每 48 h 全换,FBS 批次差异>5 % 即触发倍增时间漂移。细胞密度 1 × 10? cm?2 时 36 h 融合 80 %,超过 2 × 10? cm?2 出现多层生长。
qPCR 支原体 16S rDNA Ct≥40;14 d 培养基无浑浊;需氧/厌氧/真菌三项阴性。每批附第三方 SGS 报告,有效期 12 个月。细胞上清额外做小鼠诺如病毒 RT-PCR,阴性方可入库。
G-banding 20 个中期分裂相:40,XX;无易位、无环状染色体。阵列 CGH 显示 15qD3 2.1 Mb 重复,位于基因荒漠,功能影响可忽略。每 10 代复检核型,异常率>5 % 即淘汰。
冻存液:90 % FBS + 10 % DMSO;细胞密度 5 × 10? mL?1;程序降温盒 -1 ℃ min?1。液氮储存 24 个月复苏存活率 92 ± 3 %,24 h 贴壁率 90 %。干冰运输 48 h,温度记录器全程 -65 ℃ 以下,偏差>5 ℃ 即整批拒收。