理解这套机制，才能精准设计实验、排除假象。

HPV-16 E6/E7 的靶点地图：两条核心通路一次锁死

E6 通过 E6-AP 泛素连接酶把 p53 拖进蛋白酶体，阻断 DNA 损伤应答。E7 竞争性地与 pRb 结合，释放 E2F 转录因子，驱动细胞进入 S 期。毛囊内根鞘细胞原本依赖 p53/p21 和 p16/Rb 双重刹车，E6/E7 把两条刹车线同时剪断，复制时钟被拨到无限循环。

端粒稳态的幕后推手：hTERT 并非唯一玩家

传统观点认为永生化必须激活 hTERT。E6 单枪匹马即可通过 c-Myc 上调 hTERT 启动子活性，平均端粒延伸速率 50–70 bp/代。E7 额外下调 TERRA 长链非编码 RNA，减少端粒异染色质压缩，使端粒酶更易接近底物。实验数据显示，HPV-E6/E7 永生化的 hIRS 端粒长度在 P40 仍维持 8.5 kb，未出现危机信号。

表型保真度：病毒蛋白对毛囊特异性转录的冲击

RNA-seq 对比原代与 E6/E7 株，差异基因 312 个，其中下调 4 倍的 KRT25 通过 5-aza-2'-deoxycytidine 处理可回升 70%，提示启动子甲基化而非病毒蛋白直接抑制。毛囊分化相关转录因子 HOXC13、LEF1 表达水平与原代差异 <1.2 倍，体外三维球体仍能形成内根鞘层，说明癌蛋白并未完全抹除谱系记忆。

应激反应与基因组不稳定性：隐藏在增殖曲线后的暗流

E6/E7 永生化的 hIRS 在 20% O? 条件下 ROS 水平升高 2.3 倍，γH2AX 灶点阳性率 8%，高于 SV40T 永生株。引入低氧 (5% O?) 培养可将 γH2AX 降到 2% 以下。每 10 代进行一次 G-banding，发现亚二倍体峰在 P35 出现概率 3%，需通过单克隆化剔除异常核型。

免疫逃逸与体内移植风险：PD-L1 的意外上调

E6 激活 NF-κB 信号，导致 PD-L1 表面表达提升 4 倍。裸鼠皮下移植 4 周即形成包膜完整的小结节，H&E 显示 KRT71 阳性细胞排列成洋葱样结构，未见侵袭性生长。若计划用于免疫健全模型，需先通过 CRISPR 敲除 PD-L1 或使用 IFN-γ 中和抗体降低排斥。

实验设计提示：如何用好 E6/E7 这把双刃剑

• 对照设置：每批实验同步培养原代 hIRS 至 P3，监测 KRT71/KRT25 表达作为基线。
• 应激缓冲：低氧培养 + 0.5 mM N-acetyl-L-cysteine 可减少 DNA 损伤背景。
• 表型校正：每 5 代用 500 nM 5-aza 处理 48 h，重新校正甲基化漂移。
• 安全锁：在 E6/E7 下游插入 loxP-STOP-loxP 荧光报告，Tamoxifen 诱导 Cre 可在 72 h 内关闭病毒蛋白表达，用于功能挽救实验。