SV40 Large T 抗原的“油门”机制

SV40 Large T 抗原通过双位点锚定 pRb 口袋结构域与 p53 核心区域，释放 E2F 转录因子并抑制 p21 表达。实验测得，pRb-E2F 复合体解离率 20 min 内升至 85 %，细胞在 12 h 内完成 G1/S 过渡，倍增时间缩短至 20 ± 1 h。

hTERT 的“续航”作用

hTERT 通过 TPP1-POT1 复合体定位端粒末端，催化端粒重复序列 TTAGGG 的延伸。Southern blot 显示，P5 至 P50 代端粒长度稳定在 15 ± 0.5 kb，耗损速率仅 3 bp/PD，远低于原代细胞的 50 bp/PD。

剪切应力响应通路完整性

SV40+hTERT 双修饰未破坏动脉内皮特异性通路。15 dyn/cm2 剪切 6 h 后：

• Klf2 mRNA 上调 28 倍
• eNOS Ser1177 磷酸化提高 6.8 倍
• NO 释放量达 3.6 μM，与原代差异 < 5 %

紧密连接与屏障功能

ZO-1、Occludin、VE-cadherin 表达量与原代持平。TEER 峰值 285 ± 12 Ω·cm2，70 kDa FITC-dextran 渗透率 1.1 × 10?? cm/s，符合颈动脉内皮屏障标准。

基因组稳定性与插入图谱

双基因通过 PiggyBac 转座系统分别插入 11 号染色体 71.3 Mb 与 14 号染色体 23.7 Mb，单拷贝整合，无随机多拷贝。全基因组测序显示 SNV 负荷 1.6/Mb，Indel 负荷 0.2/Mb，均在行业警戒线以下。

永生化后表型漂移监控

每 10 代进行 RNA-seq，差异基因火山图阈值 |log?FC| > 1 且 p < 0.01。漂移基因控制在 25 个以内，且与血管功能无交集。如出现 Klf2 下调 > 50 %，立即启动单克隆化恢复。