一、操作前准备

实验操作的准确性始于前期准备，需从环境、仪器、耗材三方面严格把控。

总巯基易受氧化，实验环境需保持清洁、干燥，避免通风口直吹操作台。建议控制室温在20-25℃，相对湿度50%-70%，减少温度波动对试剂活性的影响。操作时关闭门窗，避免扬尘或气流干扰样本。

核心仪器为分光光度计，使用前需校准波长（常用412nm，具体以试剂盒说明书为准）。校准步骤：用空白缓冲液作为参比，调节透光率至100%，连续测量3次空白吸光度，误差需≤0.005，确保仪器稳定性。若使用酶标仪，需提前预热30分钟，检查微孔板是否清洁无划痕。

耗材需满足“无酶、无巯基污染”要求：离心管、移液枪头选择无菌无酶款，使用前用超纯水冲洗2次；移液枪需校准（误差≤2%），避免加样体积偏差。若处理组织或细胞样本，需准备匀浆器、高速离心机（转速≥12000g），并提前消毒。

二、样本处理

样本类型不同，处理方法差异较大，需根据样本特性选择适配方案，确保巯基基团完整保留。

贴壁细胞：用胰酶消化后离心（1000g，5分钟），弃上清，加入预冷的PBS洗涤2次，按1:5比例加入裂解液（如含1mM EDTA的PBS，pH 7.4），冰浴超声破碎（功率200W，工作3秒停5秒，共10次），4℃ 12000g离心15分钟，取上清待测。

悬浮细胞：直接离心（1000g，5分钟），后续步骤同贴壁细胞。

新鲜组织需快速液氮冷冻，研磨成粉末后按1:10比例加入裂解液（含1% Triton X-100的PBS），冰浴匀浆（转速10000rpm，匀浆30秒停10秒，共3次），4℃ 15000g离心20分钟，取上清。若样本含较多脂肪，可加入等体积氯仿-甲醇混合液（2:1）去脂，离心后取水相。

血清样本无需裂解，直接按1:2比例用试剂盒配套缓冲液稀释（若浓度过高，可适当提高稀释倍数）。血浆需避免溶血，采集后30分钟内4℃ 3000g离心10分钟，取上层血浆，-20℃保存不超过1周，避免反复冻融。

试剂盒试剂需严格按说明书复溶、稀释，避免浓度偏差影响检测结果。

多数试剂盒采用DTNB（5,5'-二硫代双硝基苯甲酸）作为显色剂，需现配现用。具体步骤：取DTNB粉末（如10mg），加入10mL缓冲液（如0.1M磷酸盐缓冲液，pH 8.0），磁力搅拌至完全溶解（约5分钟），避光保存（可用铝箔包裹容器），2小时内使用完毕。

标准品通常为谷胱甘肽（GSH）溶液（浓度10mM），需梯度稀释成标准曲线。例如：取6支离心管，分别加入900μL缓冲液，第1管加入100μL标准品（浓度1mM），混匀后取100μL加入第2管（浓度0.1mM），依次稀释至0.01mM，形成0、0.01、0.02、0.05、0.1、1mM的标准梯度。

试剂盒配套缓冲液（如Tris-HCl或PBS）需提前从4℃取出，平衡至室温（约30分钟），避免温度过低导致试剂溶解不完全。若缓冲液有沉淀，37℃水浴加热至澄清后使用。

严格遵循加样顺序和孵育条件，确保反应充分且一致。

96孔板中依次加入：空白组（100μL缓冲液）、标准品组（100μL各梯度标准品）、样本组（100μL处理后的样本上清），每组设3个复孔。随后每孔加入50μL显色剂，轻轻震荡混匀（避免气泡），用封口膜密封。

将孔板置于37℃恒温箱孵育15-20分钟（具体时间以试剂盒说明书为准）。孵育期间避免光照，可将孔板放入不透光盒中。孵育结束后，立即取出孔板，用纸巾擦去底部水渍。

分光光度计设置波长412nm，以空白组为参比，依次测量各孔吸光度（OD值）。每个样本测量3次，取平均值。若使用酶标仪，选择“单波长检测”模式，检测前需用空白孔校准。

基于标准曲线计算样本总巯基浓度，结合样本特性调整单位。

以标准品浓度（mM）为X轴，对应OD值为Y轴，用Excel或GraphPad Prism进行线性拟合，得到回归方程：Y = aX + b（a为斜率，b为截距）。要求R2≥0.99，确保线性关系良好。

样本总巯基浓度（mM）=（样本OD值 - b）/ a × 稀释倍数。若样本为组织或细胞，需结合样本质量或蛋白浓度换算单位，例如：总巯基含量（μmol/g组织）= 浓度（mM）× 裂解液体积（mL）/ 组织质量（g）× 1000。

复孔OD值相对标准偏差（RSD）需≤10%，否则需重新检测。若样本OD值超出标准曲线范围，需调整稀释倍数后重新测定。

新鲜样本建议2小时内检测；若需暂存，-80℃保存不超过1个月，避免反复冻融（冻融次数≤3次）。解冻时37℃水浴快速融化，轻轻混匀后立即检测。

显色剂需避光保存，若溶液呈黄色（未加样本时），说明已氧化失效，需重新配制。标准品稀释时使用新鲜吸头，避免交叉污染。

实验全程戴无粉手套，避免手指接触试剂或样本（皮肤分泌的巯基物质会干扰检测）。加样时缓慢推出移液器，避免产生气泡（气泡会导致OD值偏低）。