样本处理与制备

活细胞或组织样本需快速裂解以释放HK酶。推荐使用温和的含蛋白酶抑制剂RIPA缓冲液（4°C操作）。裂解后，立即进行12000g、4°C离心15分钟，收取上清液作为待测样品。血浆/血清样本需避免溶血（红细胞含高HK活性），直接低温分装备用。样本制备全程需在冰上操作，稳定性通常不超过6小时。

试剂组分精准配制

典型HK活性检测试剂盒（如PGK-20型）核心组分包括：

• 反应缓冲液（50mM Tris-HCl, pH 8.0）：维持最适酶活环境
• ATP溶液（10mM）：磷酸基团供体
• 葡萄糖溶液（100mM）：HK特异性底物
• NADP?溶液（5mM）：偶联反应电子受体
• G6PDH酶溶液（≥2 U/mL）：偶联酶，催化NADP?→NADPH
• DTT溶液（10mM，可选）：保护酶活性巯基

使用前需将所有液体组分平衡至25°C，并依据当天检测样本数精确计算配制预混工作液（避免反复冻融）。

反应体系建立与动力学监测

在96孔UV板（或石英比色皿）中依次加入：

1. 150μL 预混工作液（含缓冲液、ATP、葡萄糖、NADP?、G6PDH）
2. 20μL 待测样品/标准品

立即混匀，25°C预孵育5分钟。使用紫外分光光度计，在340nm波长下监测吸光度（OD???）变化3-5分钟。关键点：

• 温度控制：使用恒温比色槽确保全程25°C
• 时间分辨率：至少每30秒记录一次OD值
• 基线确认：反应启动前需确保OD值稳定（漂移<0.001/min）

数据分析与活性计算

HK活性单位定义为：在25°C、pH 8.0条件下，每分钟催化生成1 μmol NADPH所需的酶量。计算公式：

HK活性 (mU/mL) = (ΔOD???/min × 反应总体积 × 10?) / (ε × 光径 × 样品体积 × 1000)
ΔOD???/min：线性反应阶段斜率
ε：NADPH在340nm处的摩尔消光系数（6.22 × 103 L·mol?1·cm?1）
光径：96孔板通常为0.6 cm，比色皿为1.0 cm
反应总体积：170 μL（预混液150μL + 样品20μL）

需同步运行空白对照（以样本稀释液替代样品）和标准品曲线（已知浓度NADPH）验证系统准确性。活性值超出线性范围时（ΔOD/min > 0.3），需稀释样本复测。

关键操作干扰排除

• ATP酶干扰：样本中ATP水解酶会消耗底物。添加特异性抑制剂（如氟化钠）或使用包含ATP再生系统（磷酸肌酸激酶+磷酸肌酸）的试剂盒。
• 内源性NADPH消耗：某些组织样本含氧化酶。增加预孵育时间（10分钟），使背景反应充分进行。
• G6PDH活性不足：异常低的反应速率可能是偶联酶失活。核对试剂有效期，确保G6PDH活性≥2 U/mL工作浓度。
• 沉淀物干扰：样本离心不彻底时，颗粒物会散射光。推荐0.22μm滤膜过滤上清液。