工作原理：荧光示踪与酶解反应

CFDA（羧基荧光素二乙酸酯）是一种非极性、不带电荷的探针，可自由穿透细胞膜。进入细胞质后，细胞内酯酶将其水解为带负电荷的羧基荧光素（CFSE）。这种水解产物无法透过细胞膜，从而被滞留于细胞内。细胞分裂时，CFSE标记物平均分配至子代细胞，通过流式细胞术检测荧光强度衰减程度，即可推算出细胞分裂代数与增殖速率。

检测系统的核心组成

荧光标记模块采用CFDA探针的乙酰甲酯衍生物（CFSE），其稳定性比传统CFDA提升3倍。信号采集模块需配备488 nm激发光源和530/30 nm带通滤光片，匹配FITC检测通道。数据分析模块依赖峰型拟合算法，通过荧光强度分布直方图识别细胞分裂峰。

标准化操作流程

细胞悬液浓度需调整至1×10^6/mL，CFDA工作浓度范围为0.5-10 μM。孵育时间严格控制在37℃/30分钟，终止反应后需用预冷PBS洗涤3次。上机检测应在6小时内完成，避免荧光淬灭影响数据准确性。每次实验必须设置未染色对照组、单阳性补偿对照组及增殖诱导阳性对照组。

技术参数验证要点

荧光效率要求酯酶水解率＞95%，细胞存活率＞98%。检测灵敏度需达到可分辨8次以上细胞分裂，信噪比＞50:1。批间差控制要求荧光强度变异系数（CV）＜5%，不同仪器平台间检测结果相关系数R2＞0.95。

方法学验证要求

根据CFDA技术特点，验证指标应包含：特异性（检测非增殖细胞荧光强度衰减率＜5%）、精密度（三次重复检测增殖指数差异＜10%）、线性范围（细胞浓度在10^4-10^7/mL时与荧光信号呈线性相关）。所有验证数据需符合GLP实验室管理规范。