Sonic Hedgehog（SHH，别名HHG1）作为Hedgehog家族的核心成员，其信号传导呈现独特的双重受体抑制解放机制。与其他生长因子直接激活受体不同，SHH蛋白通过抑制Patched-1（PTCH1）受体，间接激活Smoothened（SMO）信号转导。这种"双重负调控"模式在胚胎发育模式形成、成体组织稳态维持中起核心作用，其分子细节对发育生物学研究和肿瘤模型构建具关键指导价值。

SHH前体的自剪切与双重脂质修饰

SHH初始合成为45kDa前体蛋白，含N端信号肽和C端自剪切结构域。自剪切发生在Gly197-Cys198位点，由SHH自身的催化丝氨酸攻击肽键，产生19kDa的N端信号片段（SHH-N）和25kDa的C端片段。这种intein样剪切机制不依赖外源蛋白酶，剪切效率在体外可达90%以上。

SHH-N片段获得胆固醇修饰：Cys198的巯基与胆固醇的羟基形成硫酯键。该修饰使SHH锚定于细胞膜，限制其扩散范围。同时，N端极早期（N-terminal cysteine）发生棕榈酰化，由Skinny Hedgehog（SKI/HHAT）酶催化。双重脂质修饰使SHH形成浓度梯度，在胚胎神经管中，距分泌源100μm处浓度衰减至10%，200μm处仅1%。

重组表达SHH时，若切除C端自剪切结构域，蛋白无活性。使用无胆固醇表达系统（如某些酵母）产生的SHH无法获得胆固醇修饰，虽能结合PTCH1但不能有效激活信号。这种制备缺陷在商用蛋白中常见，需通过质谱检测脂质修饰完整性。

PTCH1受体的构象锁定与SMO释放机制

PTCH1是12次跨膜蛋白，结构与胆固醇转运蛋白NPC1同源。其胞外段有两个SHH结合位点：一个位于CRD结构域（Kd≈10??M），另一个位于固醇感应域（SSD）。SHH结合后，PTCH1构象从"闭合态"转为"开放态"，SSD结构域解折叠，解除对SMO的抑制。

PTCH1对SMO的抑制依赖其胆固醇转运活性。PTCH1从细胞膜内向外出胆固醇，维持SMO的"抑制态"构象（活性环被锁定）。SHH结合阻断PTCH1的胆固醇泵功能，SMO获得膜内游离胆固醇后构象解放。使用环糊精去除膜胆固醇，即使PTCH1被抑制，SMO仍无法激活，证明胆固醇是SMO激活的第二信使。

PTCH1表达受Gli转录因子负反馈调控。Gli1结合PTCH1启动子的Gli结合位点（5'-GACCACCCA-3'），激活转录。这种负反馈使SHH信号通路具备自我限制能力。在基底细胞癌模型中，PTCH1基因突变导致其无法响应SHH，信号持续激活。

SMO受体的胆固醇依赖激活与下游信号传递

SMO是7次跨膜GPCR样蛋白，其激活直接依赖固醇类分子。Oxysterol（如20(S)-OHC）可作为SMO激动剂，结合其胞外CRD结构域（Kd≈10??M）。SHH诱导的胆固醇积累使局部oxysterol浓度升至μM级别，足以激活SMO。

激活的SMO胞内段招募Gli转录因子的抑制复合物：SUFU（Suppressor of Fused）、KIF7和PKA。SMO磷酸化SUFU的Ser342位点，促使SUFU-Gli复合物解离。冷冻电镜显示，两个SUFU分子夹住一个Gli，形成三明治结构。SMO激活后，SUFU-Gli复合物从纤毛基底运输至顶端，在顶端被PKA和CK1磷酸化，启动Gli加工。

SMO激活还招募GRK2和β-arrestin，介导SMO内吞和脱敏。GRK2磷酸化SMO C端Ser666/667位点，促使β-arrestin结合。使用GRK2抑制剂可使SMO信号延长2-3倍。这种调控在长期SHH刺激实验（>24小时）中影响显著。

Gli转录因子的加工与激活调控

哺乳动物有三个Gli基因：Gli1（转录激活因子）、Gli2（主激活因子）、Gli3（主抑制因子）。Gli2/3全长形式含激活域和抑制域，SUFU结合掩盖激活域。在纤毛顶端，PKA、CK1和GSK3β依次磷酸化Gli2/3的多个位点，形成磷酸化降解信号。

E3泛素连接酶β-TrCP识别磷酸化Gli，介导其部分蛋白酶体加工。Gli3被加工为75kDa的抑制形式（Gli3R），核定位序列保留但激活域被切除。Gli2则主要被完全降解，避免产生抑制形式。这种差异加工使Gli3成为主要抑制因子，Gli2为激活因子。

Gli1基因本身不含抑制域，其表达完全依赖SHH信号，形成正反馈。Gli1启动子含9个Gli结合位点，对SHH信号极度敏感。报告基因检测中，Gli1-Luc是SHH通路活性的金标准，其灵敏度比Gli-Luc（含Gli结合位点的通用报告基因）高10倍。

纤毛依赖的信号区室化与时空编码

初级纤毛是SHH信号的核心平台。纤毛膜富集SMO和Gli-SUFU复合物，纤毛内运输（IFT）蛋白负责信号分子的双向运输。IFT88敲除的细胞完全丧失SHH响应。活细胞成像显示，SHH刺激后SMO在纤毛的富集在30分钟内达到峰值，持续4-6小时。

纤毛基部存在"纤毛过渡区"，作为分子筛阻止胞质蛋白随机进入。ARL13B小G蛋白调控纤毛膜流动性，其突变导致SMO在纤毛异常聚集，信号过度激活（Joubert综合征）。这种区室化确保SHH信号在时间与空间上精确编码。

纤毛长度调控信号强度。SHH刺激使纤毛长度从2μm增至3-4μm，增加信号分子容量。使用细胞松弛素D抑制肌动蛋白聚合，纤毛长度增加50%，SHH信号增强2-3倍。这种机械调控在骨发育和神经管闭合中起关键作用。

信号串扰与疾病中的异常激活

SHH通路与Wnt、FGF通路交叉对话。Gli2直接结合β-catenin，增强其转录活性。在基底细胞癌中，SHH-Gli信号上调Wnt配体，形成正反馈。使用Wnt抑制剂可部分抑制SHH驱动的肿瘤生长。

在肿瘤模型中，SHH信号常发生配体非依赖性激活。PTCH1杂合缺失（Ptch1?/?）小鼠自发形成髓母细胞瘤，SMO抑制剂vismodegib可阻断肿瘤生长。但SMO突变（D473H）导致vismodegib耐药，此时需使用Gli抑制剂（如GANT61）靶向下游。

SHH信号在骨发育中调控成骨与破骨平衡。成骨细胞分泌的SHH激活破骨前体细胞，上调RANKL表达。这种旁分泌在骨折愈合中起关键作用。使用SHH-neutralizing抗体延迟骨折愈合时间2-3周。

实验操作中的浓度梯度与时间点设计

体外实验SHH浓度梯度为10-500 ng/mL。10 ng/mL可诱导Gli1表达2-3倍，50 ng/mL达到平台期（10-20倍）。浓度超过500 ng/mL不进一步增加信号，因PTCH1受体已饱和。

时间动力学：Gli2/3加工在2-4小时出现，Gli1 mRNA在6-12小时达峰，蛋白在12-24小时。长期刺激（>48小时）需每天补充SHH，因蛋白降解和受体脱敏。使用胆固醇修饰缺陷的SHH时，浓度需提高10倍，因梯度扩散受限。

在神经干细胞分化实验中，SHH浓度梯度决定细胞命运：10 ng/mL诱导腹侧神经前体，50 ng/mL诱导运动神经元，100 ng/mL诱导底板细胞。这种剂量依赖性需精确控制蛋白活性和梯度稳定性。