公司动态
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Interleukin-36 Gamma（IL-36γ，别名IL-1F9、IL-1H1、IL1RP2）是IL-1家族第9号成员，其信号机制呈现独特的蛋白酶级联激活特征。不同于IL-1β的经典分泌途径，IL-36γ通过钙蛋白酶依赖的N端剪切获得生物活性，进而组装IL-36R/IL-1RAcP异源二聚体受体复合物。深入解析这一从蛋白加工到转录激活的完整分子链条，对银屑病、炎症性肠病等疾病的细胞模型研究具重要指导价值。
IL-36γ初始翻译产物为183个氨基酸的前体蛋白，N端1-20位残基构成抑制性前域。这段前域通过静电屏蔽机制掩盖成熟区的受体结合界面：Asp3和Glu7的负电荷与成熟区Arg23、Lys24形成盐桥，锁定蛋白于非活性构象。Calpain-1在Ala20-Met21位点进行精准切除，移除抑制性前域，产生163个氨基酸的成熟肽段。
剪切后蛋白的N端序列变为Met21-Leu22-Arg23，形成完整的β三叶草折叠。Arg23与IL-36R的Asp281形成关键盐桥，亲和力提升500倍（Kd从10??M降至2×10??M）。重组表达时若在N端添加标签（如His-tag）会阻断Calpain-1识别位点，导致蛋白活性下降95%。商用IL-1F9蛋白需通过N端测序验证Met21暴露，确保批次活性一致。
Calpain-1的激活本身受钙离子浓度调控。细胞损伤时胞质Ca2?从100nM升至500-1000nM，Calpain-1自剪切获得活性。使用calpain抑制剂ALLN处理角质形成细胞，IL-36γ诱导的IL-8表达下降85%，证明酶切激活是信号起始的必要步骤。
成熟IL-36γ结合IL-36R（IL-1RL2）的胞外Ig样结构域D2和D3。IL-36R胞外段含3个Ig样结构域，D1起空间间隔作用，不参与配体结合。配体结合诱导D3构象变化，暴露二聚化臂，招募IL-1RAcP（IL-1受体辅助蛋白）形成异源二聚体。
SPR分析显示，IL-36γ与IL-36R单体亲和力Kd=3×10??M，而IL-1RAcP加入后复合物稳定性提升30倍（Kd≈10?1?M）。IL-36R的表达水平决定细胞响应阈值。静息状态角质形成细胞表面IL-36R约2,000分子/细胞，TNF-α刺激24小时后上调至50,000分子/细胞，使EC50从10ng/mL降至1ng/mL。
IL-36R的N-糖基化修饰（Asn144、Asn200）调控膜表达效率。衣霉素抑制糖基化后，受体滞留内质网，膜表达量下降70%。PNGase F去糖基化可逆性阻断配体结合，证明糖链参与构象维持。实验中应使用糖基化抑制剂作为对照，验证信号特异性。
受体二聚化使IL-36R和IL-1RAcP的TIR结构域间距缩短至3-4nm，为MyD88提供双价结合位点。MyD88通过其N端死亡结构域（DD）形成螺旋状聚合物，每个聚合物包含6-8个MyD88单体。这种超分子结构是IL-36γ信号区别于IL-1β的关键特征：IL-36γ诱导的MyD88聚合物寿命更长（平均12分钟 vs IL-1β的8分钟），导致NF-κB激活更持久。
MyD88聚合物招募IRAK4激酶。IRAK4通过DD结构域结合MyD88，随后磷酸化激活IRAK1和IRAK2。磷酸化IRAKs从复合物解离，转位至胞质激活TRAF6。这一过程呈现严格时序：IRAK4在刺激后5分钟达峰，IRAK1在10-15分钟，TRAF6泛素化活性在30分钟达最大值。
TRAF6作为E3泛素连接酶，催化自身和NEMO的K63连接多聚泛素化。质谱分析鉴定出TRAF6 Lys124位点是主要泛素化位点。突变该位点后，NF-κB激活减弱80%，但MAPK通路不受影响，证明泛素化特异性调控NF-κB分支。
活化的IKK复合物磷酸化IκBα的Ser32和Ser36位点，诱导其泛素化降解。IL-36γ刺激下，IκBα降解速度比IL-1β慢30%，刺激后30分钟降解70%，这种延迟延长信号持续时间。释放的NF-κB二聚体（p65-p50）入核，结合炎症基因启动子的κB位点。
RNA-seq数据显示，IL-36γ特异性上调IL-23A、IL-17C、CCL20和S100A9基因，而对IL-6诱导强度仅为IL-1β的50%。这种转录谱差异由共激活因子偏好性决定：IL-36γ信号更多招募CBP/p300，而IL-1β偏向SRC-1。ChIP-seq显示，IL-36γ刺激后p65在IL-23A启动子的结合强度是IL-6启动子的5倍。
MAPK通路通过TAK1激活：TAK1磷酸化MKK3/6和MKK4/7，分别启动p38MAPK和JNK通路。IL-36γ对p38α的激活强度是JNK的2倍。磷酸化p38入核激活ATF2，增强IL-36γ自身的转录，形成正反馈。使用p38抑制剂SB203580可使IL-36γ诱导的IL-8表达下降60%。
IL-36Ra是IL-36γ的天然拮抗剂，结合IL-36R但不招募IL-1RAcP。它与IL-36γ竞争IL-36R，亲和力Kd=5×10??M，与激动剂相当。IL-36Ra的N端也需要Calpain-1剪切，未剪切的全长形式无拮抗活性。
正常皮肤中IL-36Ra/IL-36γ摩尔比为15:1，确保信号静默。银屑病皮损中，IL-36γ上调200倍，而IL-36Ra仅上调10倍，比例失衡至1:3，信号被解锁。这种失衡是疾病炎症持续的核心机制。外源性补充IL-36Ra（10-50倍摩尔过量）可完全阻断IL-36γ信号。
IL-36Ra还具有部分激动活性。高浓度IL-36Ra（>100 ng/mL）可弱激活MAPK通路，幅度约为IL-36γ的15%。这种"部分激动-拮抗"双相特性在药物设计中需警惕，可能引发不可预期的免疫激活。
角质形成细胞是IL-36γ的主要靶细胞。IL-36γ刺激后，IL-23A、IL-24、S100A7和LL37表达上调50-100倍。这些因子激活Th17细胞，形成IL-23/IL-17正反馈环路。共培养实验显示，IL-36γ处理的角质形成细胞使Th17细胞IL-17A分泌增加5倍，IL-22增加3倍。
巨噬细胞响应依赖极化状态。M1型巨噬细胞高表达IL-36R，IL-36γ刺激后TNF-α和IL-1β分泌增加3-5倍；M2型IL-36R表达低10倍，几乎无响应。这种差异使IL-36γ成为调控巨噬细胞极化的潜在靶点。在关节炎滑液中，M1/M2比例与IL-36γ浓度正相关。
成纤维细胞中IL-36γ与TNF-α产生强大协同。单独IL-36γ（10 ng/mL）诱导CCL2上调10倍，TNF-α诱导50倍，联用提升至300倍。机制上，TNF-α激活的NF-κB为IL-36γ靶基因启动子解聚染色质，使IL-36γ的转录效率提升5倍。这种协同在肠道炎症中破坏黏膜修复。
体外实验IL-36γ的有效浓度范围为0.1-100 ng/mL。0.5 ng/mL激活NF-κB报告基因达到50%最大效应（EC50），5 ng/mL饱和受体（>90%最大效应）。HaCaT细胞的结合实验显示，Bmax约为30,000受体/细胞，每个受体二聚体需2-3个IL-36γ三聚体饱和。
时间梯度设计需匹配信号动力学。NF-κB激活在30-60分钟达到峰值，持续4-6小时。IκBα降解检测应在30分钟取样。p38磷酸化在15分钟达峰，2小时回到基线。趋化因子mRNA在2-4小时达峰，蛋白分泌在6-12小时。48小时后效应主要由次级细胞因子介导。
受体内化实验显示，100 ng/mL IL-36γ刺激30分钟，IL-36R内吞率约50%。使用Dynasore抑制内吞，使IL-8表达提升25%，说明内化负调控信号强度。这种内化-恢复周期约6-8小时，影响长期刺激实验设计。在3D皮肤模型中，IL-36γ的渗透深度仅50-100μm，需顶端和基底侧同时给药才能获得均匀刺激。