抗原在免疫系统中的功能执行，本质上是蛋白质三维结构与淋巴细胞受体之间立体化学匹配的动态识别过程。其工作原理横跨了抗原表位的拓扑呈现、蛋白酶体的片段化加工、MHC分子的肽段锚定、T细胞受体的构象诱导、共刺激信号的阈值调控五个时空分离的分子事件。临床免疫检测中的阳性信号，每个数值都映射着数百万次分子碰撞与构象选择的统计结果。

抗原表位的立体化学识别代码

抗原表位分为线性表位与构象表位两类。线性表位由6-12个连续氨基酸组成，其免疫原性依赖于主链肽键的取向和侧链R基团的空间矢量。构象表位由不相邻的氨基酸残基在折叠后聚集形成，平均包含15-22个氨基酸，跨越3-4个β折叠或α螺旋段。抗体Fab片段与表位结合的界面面积约为800 ?2，界面互补性Sc值>0.75为强结合。抗原表面只有约10%-15%的氨基酸残基构成有效表位，其余结构在免疫识别中呈"沉默"状态。X射线晶体学显示，抗体轻链CDR3区通常插入表位疏水核心，重链CDR2则覆盖外围极性残基，形成"锚定-包被"模式。表位结构柔性与抗体亲和力呈负相关，构象熵变ΔS每降低10 J/mol·K，Kd值改善一个数量级。

抗原加工的两条亚细胞途径

外源性抗原通过内吞体途径加工，内吞体pH降至5.0-5.5时，组织蛋白酶L和S被激活，切割抗原产生12-18肽段。内源性抗原经蛋白酶体β5i亚基加工，该亚基在IFN-γ刺激后表达上调5倍，将切割偏好从碱性残基转为疏水残基，产生8-11肽段。蛋白酶体出口端与TAP转运体形成复合物，TAP1/TAP2异二聚体以ATP依赖方式将肽段泵入内质网腔，转运速率k=0.5 s?1。ERp57分子伴侣协助肽段N端修剪，ERAP1氨肽酶切除N端延伸氨基酸，每个残基耗时约200毫秒。最终肽段长度严格匹配MHC分子结合沟槽，误差窗口±1个氨基酸。

MHC分子的肽段锚定机制

HLA-A*02:01分子的肽结合槽由α1和α2结构域构成，两个α螺旋夹一条β折叠片，形成长30 ?、宽12 ?的凹槽。锚定位点P2和P9要求特定残基：P2必须是Leu、Met或Val，P9必须是Leu或Val。主链肽键与凹槽底部Tyr7、Tyr171等保守残基形成氢键网络，N端氨基与Tyr7羟基距离2.8 ?，O端羧基与Lys146胍基形成盐桥。肽段侧链埋入凹槽深度决定结合能，每增加一个亚甲基（CH?）贡献1.2 kcal/mol。HLA分子与肽段解离半衰期t?/?=2-48小时，长半衰期肽段诱导更强的T细胞应答。空载HLA分子在细胞表面驻留仅30分钟即被内吞降解，肽段占据后寿命延长至12小时。

TCR-pMHC复合物的构象诱导匹配

T细胞受体（TCR）与pMHC结合遵循"诱导契合"模型。CDR3区插入进行初始识别，TCRα链CDR3与肽段N端4-6位氨基酸接触，β链CDR3识别C端3-5位。结合后TCR发生构象重排，Vα/Vβ结构域相对旋转5-8°，Cα/Cβ恒定区间距缩小3 ?。这种构象变化触发ITAM基序磷酸化，Lck激酶对CD3ζ链的磷酸化速率k=0.3 s?1。TCR-pMHC结合亲和力Kd为1-100 μM，远低于抗体-抗原，但T细胞通过形成免疫突触实现信号放大。突触中央cSMAC区约300个TCR分子与pMAC聚集，周边pSMAC区含LFA-1整合素，形成3-5 μm直径的分子簇。信号持续超过30分钟触发钙离子振荡，峰值浓度达800 nM，激活NFAT转录因子入核。

共刺激信号的阈值调控原理

T细胞完全活化需要第二信号。CD28与APC表面B7-1/B7-2结合，亲和力Kd=0.5 μM，该结合使IL-2转录速率提升50倍。CTLA-4竞争性结合B7分子，亲和力高出CD28 100倍（Kd=5 nM），但表达延迟2-3天，构成负反馈。PD-1/PD-L1通路在肿瘤微环境中高表达，PD-1胞内段含ITIM基序，招募SHP-1磷酸酶，使TCR信号衰减70%。阻断抗体需占据PD-L1表面>85%才能逆转抑制。共刺激信号的阈值呈现"AND门"逻辑：TCR信号提供基础磷酸化，CD28信号使ERK磷酸化水平从20%升至80%，两者缺一不可。剂量-响应曲线显示，IL-2分泌对TCR信号呈超敏响应，希尔系数n=3.5，而对CD28信号呈线性响应。

B细胞受体（BCR）的信号传导机制

BCR是膜结合型免疫球蛋白（mIg），相邻的Igα/Igβ异二聚体传递信号。抗原交联BCR后，mIg Fab段间距缩小至<20 nm，激活Lyn激酶对Igα ITAM的磷酸化。磷酸化ITAM招募Syk激酶，其串联SH2结构域与双磷酸化ITAM结合，亲和力Kd=1 nM。Syk自磷酸化Tyr525后激活PLCγ2，水解PIP?产生DAG和IP?。IP?触发内质网钙释放，DAG激活PKCβ，协同驱动B细胞活化。B细胞对抗原亲和力阈值极低，Kd<100 μM即可触发，但亲和力成熟后变为Kd<1 nM。生发中心中，高亲和力B细胞通过抗原捕获竞争获得更多Tfh辅助信号，存活率提升10倍。

抗原变异与免疫逃逸的分子策略

病毒抗原通过点突变逃逸识别。流感血凝素（HA）抗原漂移每年改变5-10个氨基酸，表位中心替换1个残基可使TCR亲和力下降10倍。HIV gp120高度糖基化，聚糖屏蔽率>50%，N-糖链分子量可达3 kDa，物理阻断抗体接触。抗原原罪现象源于记忆TCR对原始表位的高亲和力（Kd=1 μM）压制对新表位的应答（Kd=50 μM）。肿瘤细胞通过抗原加工缺陷逃逸，蛋白酶体β5i亚基突变使肽段产量下降90%，MHC I类分子表面空置率>60%。肿瘤还下调TAP转运体表达，内源性肽段无法进入ER，MHC分子被外源性肽段占据，形成"抗原混淆"。

免疫检测中的抗原构象保持

ELISA检测捕获抗体识别线性表位时，抗原需经SDS变性处理，使构象表位转为线性。识别构象表位则需保持天然折叠，包被缓冲液pH 7.4，避免有机溶剂。化学发光免疫分析采用双抗体夹心，捕获抗体结合N端线性表位，检测抗体识别C端构象表位，确保捕获的是完整蛋白而非片段。样本储存中，反复冻融使蛋白聚合，表位遮蔽率增加，-80℃可保持结构稳定6个月，4℃仅7天。protein A/G纯化抗体时，洗脱pH 3.0可导致Fab段构象改变，亲和力下降30%，需立即中和。

抗原肽疫苗的设计分子原则

肿瘤新抗原疫苗设计依赖测序识别突变肽段。每个突变产生约5-8条潜在表位，需计算其与患者HLA分子的结合亲和力，NetMHCpan算法预测结合亲和力<500 nM为候选。疫苗肽段长度选择25-30个氨基酸，允许APC交叉呈递，既含CD8+T细胞表位（8-11肽）也含CD4+辅助表位（15-18肽）。肽段N端乙酰化、C端酰胺化可提升稳定性，防止氨肽酶降解。脂质体包裹保护肽段免受血清蛋白酶切割，包封率需>80%。佐剂效应通过TLR激动剂实现，TLR3配体poly(I:C)激活DC交叉呈递能力，提呈效率提升5倍。疫苗接种后，特异性T细胞频率需检测四聚体染色，>0.1%为有效应答。