Lysis Buffer:50 mM NaH?PO?,300 mM NaCl,pH 8.0,0.1 % Tween-20,预先加入 1× 蛋白酶抑制剂,EDTA 浓度 0 mM,避免镍离子被螯合。
Wash Buffer:20 mM 咪唑,pH 8.0,电导 29 mS/cm,让宿主蛋白先松动,His-tag 蛋白仍与 Ni2? 保持八面体配位。
Elution Buffer:250 mM 咪唑,pH 8.0,一步洗脱,收集 3 × 0.5 mL 分段,纯度梯度实测 92 %→98 %→95 %,中间段直接用于后续结晶。
实测数据:KTP2001 vs 分装自配
E. coli 表达 42 kDa His-GST,上样 5 mL 澄清裂解液,总蛋白 12 mg:
体系
洗脱体积 (mL)
目标量 (mg)
纯度 (%)
耗时 (h)
自配缓冲液+散装树脂
4
3.2
88
4.5
KTP2001 试剂盒
1.5
4.1
96
2
回收率提升 28 %,纯度再提 8 个百分点,操作时间砍半,研究生午休前拿到样品。
把试剂盒写进论文,方法学一次过审
“Protein was purified using a His-tag protein purification kit (KTP2001, Ni-NTA resin 90 μm, 250 mM imidazole elution) following the manufacturer's 2-h protocol.” 一行写清货号、粒径、洗脱条件,编辑不再要求补充细节。
实验室省钱技巧:一盒三用
小规模筛选:1 mL 离心柱,50 mL 菌液就能跑 2 mg 蛋白,先做活性预实验再放大。
柱再生:50 mM EDTA 剥镍→0.5 M NaOH 30 min→重挂 NiSO?,循环 5 次载量下降 <3 %,平摊成本 40 %。
缓冲液兼容:Elution Buffer 含 250 mM 咪唑,直接上 SEC 不换液,省脱盐柱费用。