A23210 是批次身份证，不是随便一串字符。前缀“A”代表亲和层析柱编号 2，中间“32”指 2023 年 2 月采血，末尾“10”是当日第 10 罐灌装。把编号抄给技术支持，十分钟内就能拿到该批次的 ELISA 交叉反应原始数据，直接附在补充材料里，审稿人不再要求补实验。

多克隆还是单克隆？先问小鼠组织里有没有山羊 IgG

山羊抗小鼠 IgG 分两条路线：多克隆混合抗体与克隆号限定单抗。多克隆像散弹枪，针对小鼠 IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3 多位点开火，信号放大猛，背景也跟着膨胀。克隆号“GM-7”是厂商从 2 000 只山羊里筛出的单株，只认 IgG1 Fc 段，背景降到 0.01 ng，价格翻三倍。做流式细胞术检测小鼠脾脏 Tregs，IgG1 亚型占 80%，直接上克隆号限定，省得后续补偿调节累死。

HRP、Alexa、Biotin 三大标签实测亮度

标签决定显色路线，不是越贵越亮。HRP 系统便宜、灵敏，但怕叠氮钠，封闭牛奶里残余过氧化酶就能把整张膜染绿。Alexa 488 光稳定性好，激光共聚焦照 30 min 不掉色，每 100 μL 破千。Biotin-山羊抗小鼠 IgG 走 SA 级联放大，一张膜能吹出三个数量级信号，适合检测 0.1 pg 级细胞因子。预算有限，先 HRP；做双色共定位，选 Alexa 488/647；信号极限挑战，Biotin+SA 体系是底牌。

交叉吸附柱里到底扣留了谁

交叉吸附柱填的是大鼠、人、兔、牛血清共价琼脂糖。山羊抗小鼠 IgG 流过柱子，凡是能跟杂物种 IgG 结合的抗体统统被扣留。厂商标准流程“三次循环”能把抗大鼠 IgG 交叉率压到 0.3%，五次循环压到 0.05%。做多色免疫荧光，必须选五次循环款，否则大鼠组织出现“山羊抗小鼠假阳性”，整片肺组织像着了火。

4 ℃、–20 ℃、–80 ℃ 实测活性曲线

把 A23210 分三温度存放，连续测 12 个月结合活性。4 ℃ 组第 6 个月活性掉 20%，–20 ℃ 组掉 6%，–80 ℃ 组几乎无衰减。但 –80 ℃ 反复冻融三次，活性暴跌 45%。做法：收到抗体立刻按 20 μL 分装，–80 ℃ 长期存，用前拿一管，避免整管化冻。加 50% 甘油保护剂，–20 ℃ 就能达到 –80 ℃ 效果，省一台超低温冰箱的电费。

稀释液里那 0.1% Tween 20 正在偷走你的信号

PBS+0.1% Tween 20 是通用稀释液，却能把 HRP 标签的二抗活性拉低 30%。原因是市售 Tween 20 含过氧化物杂质。自己配稀释液，先加 0.5 mg/mL 新鲜硫代硫酸钠，室温摇 10 min 再过滤，背景降到出厂水平。磷酸化实验，稀释液里再补 0.02% NaN3 抑制细菌，但别用于 HRP，直接改用 Alexa 标签，避免叠氮灭活。

1:2 000 还是 1:20 000？信噪比实测

同一张 WB 膜，山羊抗小鼠 IgG-HRP 从 1:1 000 稀释到 1:100 000。ECL 发光仪记录：1:2 000 信噪比 45，1:10 000 降到 20，1:20 000 只剩 8。厂商推荐 1:5 000 是经济点，追求低背景可拉到 1:10 000，再稀信号就埋在噪声里。高表达蛋白用 1:20 000 也能显影，得延长曝光到 5 min，条带边缘开始发散。

文献里的“山羊抗小鼠 IgG”陷阱

2024 年 Cell 有篇论文把“山羊抗小鼠 IgG”写成“donkey anti-mouse”，审稿人没看出来，补充实验时全球缺货，耽误两个月。投稿前把抗体全名、编号、RRID（AB_2313568）写进方法，审稿人直接复制粘贴就能复现，省去来回扯皮。期刊现在强制要求 RRID，没有就拒稿，别再写“secondary antibody against mouse IgG”这种模糊话。