1. 回温节奏决定聚合风险

A23110 含 50% 甘油，-20 °C 取出后手心旋转 30 s，冰晶尚未全融即可开盖。37 °C 水浴 1 min 虽快，管壁温度瞬间升高 40 °C，抗体聚集率从 1% 升到 5%，WB 出现拖尾。慢回温把聚集控制在 1% 以内，信号边缘锐度提高 20%。

2. 稀释液盐度与背景跷跷板

用纯水稀释到 1:1000，离子强度 3 mM，非特异静电吸附暴增，NC 膜整张灰。把 PBS 调到 100 mM NaCl，盐度回到 0.1 M，背景灰度从 25 降到 5，信号不降。盐度再升到 0.3 M，目标条带开始掉色，0.1 M 是 A23110 的“甜蜜点”。

3. 孵育盒材质影响液层厚度

PP 方盒底部平整，液层 2 mm，抗体扩散系数 6×10?? cm2/s，30 min 即可达到膜表面饱和。PET 盒底部微凹，液层 4 mm，扩散时间延长到 55 min，信号强度相同，时间被拉长。选 PP 盒， incubation 时间直接写 30 min，无需再摸条件。

4. 振荡频率与气泡陷阱

摇床 80 rpm，振幅 10 mm，液体剪切力 0.8 dyn/cm2，A23110 结合速率最快。转速提到 120 rpm，剪切升到 1.4 dyn/cm2，气泡卷入，膜表面形成“白点”伪影。降到 40 rpm，边界层增厚，信号下降 15%。80 rpm 是厂家用 1 ng 抗原测出的拐点，照抄即可。

5. 洗膜角度与残留抗体

倾倒废液时膜垂直 90°，液面拉出一条“水线”，水线以上抗体残留 30%。倾斜 30° 倾倒，液面均匀下降，残留降到 5%。洗膜三回合，每回合倾斜换边，背景直接掉一档，不用额外加封闭液。

6. 底物温度与酶促线性

ECL 底物 4 °C 取出即用，催化速率低 20%，曝光时间被迫拉长，容易过曝。底物室温放 5 min，温度升到 20 °C，A23110 的 HRP 标记进入线性区，1 min 曝光刚好落在胶片线性中段。底物超 25 °C，背景火箭式上升，20 °C 是酶促线性+低背景的双赢点。

7. 曝光节奏与“湿膜窗口”

ECL 反应后膜表面 0.5 μL/cm2 液层，湿态信号最强，风吹 3 min 液层蒸发，信号掉 30%。设定计时器 2 min 内完成第一次曝光，湿膜直接进 CCD，灰度值落在最高线性区。需要重复曝光，把膜回 PBS 再湿 10 s，信号恢复到 95%，超过 5 min 再湿也拉不回。

8. 批次校准与“灰度锚点”

每批 A23110 到货，跑 20 μg 293T 裂解液，小鼠抗 β-actin 1:2000，二抗 1:5000，曝光 5 s，灰度值 80±5 定为“锚点”。后续实验先跑锚点样，灰度偏离 >10% 即调二抗浓度，把信号拉回 80，数据跨批次 CV 压到 5% 以下，投稿不用补批次差异图。